前面給大家簡(jiǎn)單介紹過m6A甲基化的概念，也給大家介紹了
?corrplot展示m6a甲基化基因表達(dá)相關(guān)性
?m6a甲基化相關(guān)基因根據(jù)臨床信息分組繪制boxplot并顯示p值
m6A檢測(cè)方法
最近幾年來m6A研究迅速發(fā)展，正是得益于meRIP-seq技術(shù)的開發(fā)及應(yīng)用。meRIP-seq高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，能夠高效精確檢測(cè)全轉(zhuǎn)錄組不同的RNA 甲基化，是成功發(fā)現(xiàn)RNA 甲基化機(jī)理及功能的關(guān)鍵技術(shù)。MeRIP-seq 技術(shù)將甲基化DNA 免疫共沉淀(methylated DNA immunoprecipitation， MeDIP) 技術(shù)、RNA 結(jié)合蛋白免疫共沉淀(RNA immunoprecipitation，RIP)技術(shù)和RNA 測(cè)序(RNA sequencing，RNA-seq) 技術(shù)組合起來，高精度地檢測(cè)全基因組(或全轉(zhuǎn)錄組)范圍內(nèi)的RNA 甲基化。MeRIP-seq 技術(shù)采用免疫共沉淀方法，即甲基化RNA 特異性抗體與被隨機(jī)打斷的RNA 片段進(jìn)行孵育，抓取有甲基化修飾的片段進(jìn)行測(cè)序(IP),同時(shí)需要平行測(cè)序一個(gè)對(duì)照(Input)樣本，對(duì)照樣本用于消除抓取帶有甲基化片段過程中的背景。然后將免疫共沉淀(IP)樣本和對(duì)照樣本中的序列片段對(duì)比(或定位)到參考基因組/ 轉(zhuǎn)錄組上，檢測(cè)RNA 甲基化位點(diǎn)。對(duì)照樣本測(cè)量對(duì)應(yīng)RNA 的表達(dá)量，本質(zhì)上是RNA-seq 數(shù)據(jù)。
MeRIP-seq 技術(shù)檢測(cè)m6A 技術(shù)流程
當(dāng)然做完IP我們也可以直接做qPCR，稱為MeRIP-qPCR，大體流程如下
第一步，先對(duì)RNA進(jìn)行特異性富集和打斷。即在打斷之前，我們需要搞清楚研究對(duì)象只是mRNA還是lncRNA。若只研究mRNA 可以先用oligodT磁珠進(jìn)行富集后再進(jìn)行打斷。如果是lncRNA和mRNA都要研究，則需要先用試劑盒將total RNA的rRNA先去除干凈，再進(jìn)行打斷。如果是進(jìn)行高通量測(cè)序打斷長(zhǎng)度約為100nt左右，而qPCR 則需要長(zhǎng)度至少在200nt以上，部分論文甚至打斷長(zhǎng)度在300-500nt左右。一般根據(jù)文獻(xiàn)中的資料顯示，IP下來的片段用引物擴(kuò)增出來的長(zhǎng)度在130-150左右，所以100nt不到的長(zhǎng)度要設(shè)計(jì)出合適的引物會(huì)非常困難。除非是用5’RACE擴(kuò)增，否則還是建議大于200nt。當(dāng)然了，如果不打斷的話設(shè)計(jì)引物就會(huì)比較方便。當(dāng)然如果 total RNA 本身量比較少，建議直接用 m6A 抗體對(duì) total RNA 進(jìn)行富集。
第二步，對(duì) RNA 進(jìn)行抗體孵育和特異性富集。打斷完了 RNA 我們會(huì)得到長(zhǎng)度約為 200-300 的 RNA 片段。如果是不打斷則是較為完整的 RNA 全長(zhǎng)。這時(shí)候我們可以分出約占 m6A-IP 部分 RNA 只有 10%的 RNA 作為 input。當(dāng)然如果是細(xì)胞樣本比較充足，Input 和 IP 的比例可以直接是 1:1。如果按照 1:1:1，簡(jiǎn)單來說用于 m6A IP 的 RNA 有,3μg，那么 Input、
IP 和 IgG 的 RNA 都在 1μg 左右（無論是 total RNA 還是 mRNA）。
第三步，洗脫和逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增。接下來我們需要對(duì)m6A抗體和IgG抗體上洗脫下來的RNA，以及input的RNA，按照常規(guī)試劑盒要求進(jìn)行洗脫，并用隨機(jī)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。
第四步，設(shè)計(jì)m6A-IP–qPCR 的特異性引物。由于m6A甲基化基本富集在UTR區(qū)和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)，所以如上圖所示在這些區(qū)域附近我們可以從測(cè)序結(jié)果里有明顯的peak峰。那么我們?cè)O(shè)計(jì)引物可以考慮在基因高甲基化區(qū)域來進(jìn)行。如果某幾個(gè)常見的基因在不同文獻(xiàn)里頻繁出現(xiàn)，那么文獻(xiàn)里列出來的引物可以被我們直接拿來引用。通常最后PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度會(huì)在130-150bp左右。這里需要注意的是，IP下來的RNA需要用隨機(jī)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，而第四步中設(shè)計(jì)的引物用的是特異性引物，這個(gè)大家要注意區(qū)分和甄別。
第五步，使用上一步設(shè)計(jì)好的引物，對(duì)input、m6A-IP和IgG-IP中的RNA進(jìn)行qPCR反應(yīng)并計(jì)算相應(yīng)的CT值。
MeRIP-qPCR結(jié)果的計(jì)算
MeRIP-qPCR結(jié)果計(jì)算如下表:
其中DF和IF分別是稀釋倍數(shù)。是說一個(gè)樣品，由于其中IP到的RNA量一定會(huì)比不IP直接保留的Input的RNA量少很多，IP和Input實(shí)際取來做逆轉(zhuǎn)錄+qPCR的模板稀釋倍數(shù)不同，因此要把這個(gè)倍數(shù)考慮進(jìn)去。比如15μg的片段化RNA經(jīng)過IP后的RNA全部拿去做IP樣品的qPCR實(shí)驗(yàn)得到Ct值A(chǔ)1, 另3μg的片段化RNA用來作為Input樣品qPCR得到Ct值B1，則%(IP/Input)=2(B1-A1)（3/15）*100。IgG/Input的計(jì)算也是同理。
