1.創(chuàng)建工作目錄，工作目錄下存放公司處理過(guò)的 cleandata 和 mapping.txt

圖1

2.使用 validate_mapping_file.py 驗(yàn)證 mapping.txt 格式是否正確

validate_mapping_file.py -m mapping.txt -o validate_mapping_file_output

圖2

在文件管理中找到該.html文件，雙擊打開

圖3

由于是 cleandata，故不需要填寫 barcode 和 prime 信息

3.使用 split_libraries_fastq.py 切分?jǐn)?shù)據(jù)（主要目的：得到seqs.fna）

mkdir split

split_libraries_fastq.py -i yourmerged.fastq(1.fastq,2.fastq,3.fastq......) -o split -m mapping.txt --barcode_type 'not-barcoded' --sample_id yourfastqid(1,2,3.....)

4.使用 pick_otus.py 進(jìn)行OTU聚類

mkdir otus

pick_otus.py -i split/seqs.fna -o otus -m uclust_ref -s 0.97 -z -r /usr/local/lib/python2.7/dist-packages/qiime_default_reference/gg_13_8_otus/rep_set/97_otus.fasta

5.使用 pick_rep.set.py 選擇代表性O(shè)TU序列

mkdir rep_otu

pick_rep_set.py -i otus/seqs_otus.txt -f split/seqs.fna -o rep_otu/rep_set.fna

6.使用 align_seqs.py 進(jìn)行多序列比對(duì)

mkdir align

align_seqs.py -i? rep_otu/rep_set.fna -o align -m pynast -a uclust -p 0.75 -t /usr/local/lib/python2.7/dist-packages/qiime_default_reference/gg_13_8_otus/rep_set_aligned/85_otus.pynast.fasta

7.使用 filter_alignment.py 過(guò)濾比對(duì)結(jié)果

mkdir filter

filter_alignment.py -i align/rep_set_aligned.fasta -o filter

8.使用 make_phylogeny.py 構(gòu)建進(jìn)化樹

mkdir phylogeny

make_phylogeny.py -i filter/rep_set_aligned_pfiltered.fasta -o phylogeny/rep_set.tre -t fasttree

9.使用 assign_taxonomy.py 進(jìn)行物種分類注釋

assign_taxonomy.py -i rep_otu/rep_set.fna -r /usr/local/lib/python2.7/dist-packages/qiime_default_reference/gg_13_8_otus/rep_set/97_otus.fasta -t /usr/local/lib/python2.7/dist-packages/qiime_default_reference/gg_13_8_otus/taxonomy/97_otu_taxonomy.txt -m uclust

10.使用 make_otu_table.py 生成 OTUs table

mkdir otu_table

make_otu_table.py -i otus/seqs_otus.txt -t uclust_assigned_taxonomy/rep_set_tax_assignments.txt -o otu_table/otu_table.biom

11.使用 biom convert 將轉(zhuǎn)換biom文件格式為txt格式

mkdir biom

biom convert -i otu_table/otu_table.biom -o biom/otu_table.txt --to-tsv

12.使用 biom convert 統(tǒng)計(jì) otu_table.biom

biom summarize-table -i otu_table/otu_table.biom -o biom/table.summary.txt

13.處理 OTU table

1）按mapping文件順序排序

mkdir otu_table_handle

sort_otu_table.py -i otu_table/otu_table.biom -m mapping.txt -o otu_table_handle/sorted_otu_table.biom

2）過(guò)濾 OTU 數(shù)量大于1

filter_otus_from_otu_table.py -i otu_table_handle/sorted_otu_table.biom -o otu_table_handle/otu_table_mc2.biom -n 2

3）刪除異常樣品

filter_samples_from_otu_table.py (自行查閱說(shuō)明)