Nat Biotech | 高通量單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)實現(xiàn)單日分析5000個細(xì)胞
原創(chuàng)?存在一棵樹?圖靈基因?2022-07-29 10:03?發(fā)表于江蘇
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撰文：存在一棵樹
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開發(fā)名為?plexDIA?的實驗框架，將肽的平行分析與樣品的平行分析相結(jié)合，以實現(xiàn)通量的成倍增加可用于多路復(fù)用的樣品分析，其在不降低蛋白質(zhì)組覆蓋率和準(zhǔn)確性的前提下通過增加標(biāo)簽數(shù)量從而成倍地增加通量。
德國柏林Charité醫(yī)學(xué)院定量蛋白質(zhì)組學(xué)系教授Vadim Demichev與美國東北大學(xué)的Nikolai Slavov教授近期在《Nature Biotechnology?》上發(fā)表了一篇名為“Increasing the throughput of sensitive proteomics by plexDIA”的文章。本文開發(fā)一個通用框架和分析流程，以通過plexDIA提高定量蛋白質(zhì)分析的吞吐量與靈敏度。
質(zhì)譜?(MS)是可以實現(xiàn)高覆蓋、低缺失、高通量和高靈敏度蛋白質(zhì)組學(xué)分析的方法，但同時實現(xiàn)以上優(yōu)勢仍是一項巨大的挑戰(zhàn)，特別是對于需要單細(xì)胞蛋白質(zhì)分析的項目。為實現(xiàn)這一目標(biāo)，通常通過以下兩種策略來增加蛋白質(zhì)分析的通量：?1)?通過化學(xué)標(biāo)記提高樣品通量和穩(wěn)定性；2)?通過平行分析多重肽減少每個樣品的MS分析時間。如圖1所示，本團隊聯(lián)合以上兩種策略，即數(shù)據(jù)獨立采集?(DIA)策略結(jié)合非等壓質(zhì)量標(biāo)簽，以實現(xiàn)對有限樣本量的蛋白質(zhì)組進(jìn)行量化速率的倍增。
這里團隊評估了plexDIA相對于匹配的?LF-DIA?分析是否可以增加定量數(shù)據(jù)點的數(shù)量，且同時保持相似的定量準(zhǔn)確性。如圖2所示，將plexDIA與?LF-DIA直接應(yīng)用于500 ng?蛋白質(zhì)樣品的分析以進(jìn)行基準(zhǔn)測試，發(fā)現(xiàn)與數(shù)據(jù)相關(guān)采集?(DDA)運行相比，DIA運行使plexDIA的吞吐量成倍增加；與LF-DIA相比，plexDIA?提高了跨樣本的數(shù)據(jù)完整性，其定量精度和重復(fù)性與LF-DIA相似，對蛋白質(zhì)豐度差異估計也相似，但在plexDIA?實現(xiàn)了與?LF-DIA?相似統(tǒng)計能力的前提下，其使用的儀器時間和費用減少了三倍。
除以上評估之外，該團隊還應(yīng)用?plexDIA?來量化?U-937?單核細(xì)胞整個細(xì)胞分裂周期(CDC)?的蛋白質(zhì)豐度。首先，對來自分選細(xì)胞的肽用非等壓同位素標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記；然后通過?MS1?優(yōu)化?(V1)?和?MS2?優(yōu)化?(V2) plexDIA?方法進(jìn)行組合分析；使用?DIA-NN?分析?V1?和?V2?數(shù)據(jù)產(chǎn)生了?4,391?個獨特的蛋白質(zhì)組和?4,107?個基因組，隨后將基因水平信息用于下游蛋白質(zhì)集富集分析?(PSEA)?和差異蛋白質(zhì)豐度分析；V1和?V2數(shù)據(jù)表明非常相似的?PSEA?模式，并確定了典型的CDC過程。如圖3所示，預(yù)期的CDC動態(tài)以及V1?和V2結(jié)果之間的一致性證明了?plexDIA?在生物學(xué)研究中的實用性，其分析小樣本的能力使得根據(jù)細(xì)胞的DNA含量從CDC的不同階段分離出細(xì)胞成為可能。
隨后，該團隊還評估了?plexDIA?量化單個人類細(xì)胞中蛋白質(zhì)的潛力。為測試其對不同類型的?MS?探測器、軌道阱和飛行時間?(TOF)?探測器的普遍適用性，以及利用離子淌度技術(shù)的能力，這里使用了timsTOF SCP和?Q Exactive classic兩個商業(yè)平臺來進(jìn)行單細(xì)胞plexDIA?樣本分析。如圖4所示，plexDIA?分析產(chǎn)生的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組的數(shù)據(jù)完整性都很高，在timsTOF SCP?分析的標(biāo)記集內(nèi)超過98%，在Q Exactive中保持在50%以上；plexDIA?量化了跨越?1,000?倍動態(tài)范圍的蛋白質(zhì)倍數(shù)變化，并與從100個細(xì)胞大樣本中量化的相應(yīng)倍數(shù)變化表現(xiàn)出良好的一致性；表明plexDIA?可以提高單細(xì)胞蛋白質(zhì)組分析的靈敏度，從而提高數(shù)據(jù)的完整性，尤其是在蛋白質(zhì)組非常不同的細(xì)胞之間。
綜上，本文證明了plexDIA可以通過使用DIA?分析、優(yōu)化高plex?非等壓質(zhì)量標(biāo)簽進(jìn)行縮放，從而大大增加敏感蛋白質(zhì)分析的吞吐量和可訪問性，且這種標(biāo)簽的設(shè)計和制造比等壓標(biāo)簽更容易、更便宜。因此，將3-plexDIA?結(jié)果外推到?100-plexDIA，這使單個MS儀器每天的工作效率達(dá)到可分析5,000個細(xì)胞的蛋白質(zhì)組成為可能。
教授介紹
Nikolai Slavov，美國東北大學(xué)生物學(xué)系和化學(xué)與化學(xué)生物學(xué)副教授。2004年在麻省理工學(xué)院（MIT）獲得生物學(xué)學(xué)士學(xué)位，隨后他在普林斯頓大學(xué)的Botstein實驗室進(jìn)行博士研究；?2010博士畢業(yè)后，在麻省理工學(xué)院的范奧德納爾登實驗室開始了一個博士后項目。獲得了未擾動野生型細(xì)胞中核心核糖體蛋白之間差異化學(xué)計量的直接證據(jù)，該發(fā)現(xiàn)支持了具有不同蛋白質(zhì)組成和生理功能的核糖體的存在，這些核糖體代表了已探索的調(diào)節(jié)基因表達(dá)層。其實驗室的研究重點包括：單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)、核糖體介導(dǎo)的翻譯調(diào)控、定量系統(tǒng)生物學(xué)與質(zhì)譜。最近，Slavov實驗室通過質(zhì)譜（SCoPE-MS和SCoPE2）開發(fā)了高通量單細(xì)胞ProtEomics的方法，并使用它們來量化細(xì)胞分化過程中的蛋白質(zhì)組異質(zhì)性。
參考文獻(xiàn)
Derks, Jason et al. “Increasing the throughput of sensitive proteomics by plexDIA.” Nature biotechnology, 10.1038/s41587-022-01389-w. 14 Jul. 2022.
