周五組會上，大家亂成一鍋粥。導(dǎo)師正拿著一篇「綜述」愁眉苦臉感嘆道：「經(jīng)費、樣本、時間，都打水漂了呀！」
師妹：難怪 WB 實驗結(jié)果總跳，還以為是人品問題！
師弟：天??！我的轉(zhuǎn)基因鼠、我的抗體、我沒日沒夜配的膠！
師姐：我還以為是大家的實驗操作問題，讓師弟師妹們優(yōu)化樣品、跑膠、轉(zhuǎn)膜、曝光，真的沒有想到是內(nèi)參的問題。
原來，本次混亂的起因是一篇綜述文章，于 2024 年 9 月發(fā)表在Ageing Research Reviews，題目為 Resolving the current controversy of use and reuse of housekeeping proteins in ageing research Focus on saving people’s tax dollars。實驗室最常規(guī)的 Western 實驗，竟因為內(nèi)參的不當(dāng)使用，而淪為經(jīng)費的「吞金獸」。
圖源：文獻(xiàn)截圖
WB 實驗中，很多實驗人員認(rèn)為管家蛋白（如 β-actin、GAPDH 和 Tubulin）的表達(dá)量穩(wěn)定一致，常常用作內(nèi)參，所以千方百計地想把內(nèi)參跑平。然而，這篇綜述指出這些所謂「穩(wěn)定」表達(dá)管家蛋白并非在所有條件下都穩(wěn)定，不同的細(xì)胞類型、發(fā)育階段，以及衰老、壓力、藥物或刺激治療下管家蛋白的表達(dá)均會發(fā)生變化。如：
β-actin 的表達(dá)可能受到細(xì)胞應(yīng)激的影響；
GAPDH 水平可能在糖酵解氧化應(yīng)激/線粒體條件下變化。
這也意味著我們之前做過的大量 WB 實驗結(jié)果可能并不準(zhǔn)確，為了獲得一張跑平的內(nèi)參，以及符合預(yù)期的目的條帶，實驗人員不得不反復(fù)實驗，既浪費了時間和精力，又耗費了課題組的實驗經(jīng)費，使得 WB 淪為「實驗黑洞」。
由于這些潛在的可變性，驗證每個特定實驗條件下管家蛋白的穩(wěn)定性至關(guān)重要。為了提高 Western 實驗的成功率和結(jié)果準(zhǔn)確度，作者提出了 4 個解決方案，以此減少對單一管家蛋白的依賴，并減少重復(fù)實驗的時間以及費用成本：
正式實驗前，通過 WB 預(yù)實驗來評估管家蛋白表達(dá)的一致性；
采用其他定量技術(shù)，如定量 PCR 或質(zhì)譜，來確定管家蛋白的 mRNA 或蛋白水平；
管家蛋白的分子量應(yīng)與實驗?zāi)繕?biāo)蛋白的分子量有所區(qū)別，避免條帶重疊；
凝膠電泳的運行條件，包括是否使用梯度或固定濃度，需要提前考慮；
此外，該論文還推薦了「總蛋白染色技術(shù)」以替代傳統(tǒng)內(nèi)參，總蛋白染色適用于廣泛的樣本類型，消除了傳統(tǒng)內(nèi)參蛋白表達(dá)量容易受影響的問題。這種染色方法不僅具有成本效益，易于使用，而且與不同樣本兼容（包括管家蛋白表達(dá)不穩(wěn)定的樣本）。同時，不用過多考慮電泳條件，不需要將傳統(tǒng)內(nèi)參與目的蛋白進(jìn)行分離，被推薦作為 Western Blot 實驗中的一種更優(yōu)的內(nèi)參方法。
Stain-Free 技術(shù)，正是一種總蛋白染色方法，Stain-Free 成像技術(shù)利用含有專有三鹵化合物的聚丙烯酰胺凝膠，通過短暫的光活化直接使凝膠中的蛋白質(zhì)產(chǎn)生熒光，無需額外染色步驟即可在電泳和 WB 過程中立即可視化蛋白質(zhì)。它不依賴于單一的蛋白質(zhì)內(nèi)參，而是利用熒光標(biāo)記來檢測凝膠或印跡膜上的總蛋白含量。
省時省錢：WB 結(jié)果雙保險
1、Stain-Free 技術(shù)：簡化實驗的熒光標(biāo)記法
Stain-Free 技術(shù)的核心在于利用熒光染料對凝膠或印跡膜上的總蛋白進(jìn)行標(biāo)記，從而實現(xiàn)對樣品加載量的直接和定量評估。
這種方法的優(yōu)勢在于其快速性和靈敏性，能夠在不依賴于特定蛋白質(zhì)內(nèi)參的情況下，提供一種全面的蛋白質(zhì)負(fù)荷視圖。
2、Stain-Free 技術(shù)：省心省力的多重優(yōu)勢
與傳統(tǒng)的總?cè)旧椒ㄏ啾?，Stain-Free 技術(shù)具有操作簡便、節(jié)省時間和成本的優(yōu)勢。
操作簡便性：Stain-Free 技術(shù)避免了傳統(tǒng)染色的復(fù)雜步驟，使得實驗操作更加快捷和簡便。
時間和成本效率：無需額外染色，減少了實驗時間，同時降低了試劑使用成本，提高了實驗的經(jīng)濟(jì)性。
結(jié)果準(zhǔn)確性：Stain-Free 技術(shù)提供了總蛋白水平的均勻性驗證，確保了樣品加載量的一致性，從而提高了實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。
舉個例子，研究中傳統(tǒng)內(nèi)參蛋白 Vinculin 的條帶在實驗中表現(xiàn)出不一致的變化，而 Stain-Free 技術(shù)所顯示的總蛋白水平則表明樣品加載量是均勻的。
圖片來源：參考文獻(xiàn) 2
依賴單一的 Vinculin 作為內(nèi)參，研究者可能需要對樣品加載量進(jìn)行調(diào)整，這不僅增加了實驗的操作復(fù)雜性，而且可能會引起目標(biāo)蛋白表達(dá)量的不準(zhǔn)確定量，進(jìn)而影響實驗結(jié)論的可靠性。因此 Stain-Free 展示的總蛋白成為 WB 實驗的第二保險。
參考文獻(xiàn)
[1]. Resolving the current controversy of use and reuse of housekeeping proteins in ageing research: Focus on saving people's tax dollars. Ageing Res Rev. 2024 Sep
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