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//文獻(xiàn)
2021年發(fā)表于Cancer Discovery，影響因子39.397，典型的幾乎純分析的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組文章。
Resolving the spatial and cellular architecture of lung adenocarcinoma by multi-region single-cell sequencing
//摘要
文章對來自5 個早期 LUAD 和 14 個多區(qū)域距離腫瘤很近的正常肺組織的186,916 個細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞 RNA 測序。展示了從正常區(qū)域向LUAD轉(zhuǎn)變的細(xì)胞譜系、狀態(tài)和轉(zhuǎn)錄特征。LUAD表現(xiàn)出明顯的腫瘤內(nèi)單個位點的細(xì)胞異質(zhì)性和轉(zhuǎn)錄譜系可塑性。T regulatory cell在與LUAD 接近的正常組織中的細(xì)胞中增加，細(xì)胞毒性 CD8+ T 細(xì)胞、抗原呈遞巨噬細(xì)胞、炎性樹突狀細(xì)胞減少。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn) LUAD 配體-受體相互作用中具有介導(dǎo)促腫瘤表型的上皮CD24表達(dá)增加。這些數(shù)據(jù)提供了 LUAD 演化的空間圖譜，以及用于識別治療目標(biāo)的數(shù)據(jù)資源。
//實驗設(shè)計
文章在單細(xì)胞分辨率上辨別周圍肺和早期 LUAD 的空間圖譜，以更好地理解 LUAD 演化的結(jié)構(gòu)。我們對 19 個空間區(qū)域進(jìn)行了深度 scRNA-seq 分析，包括富集的上皮細(xì)胞群，來自 5 個早期 LUAD 和 14 個多區(qū)域距離腫瘤很近的正常肺組織。 文章致力于揭開LUAD腫瘤進(jìn)化軌跡，細(xì)胞群的空間進(jìn)化，以及描述早期 LUAD 的表達(dá)特征。
5例早期LUAD，P2-P5分別取腫瘤、癌旁、中間、遠(yuǎn)端組織，P1無中間樣本。
//分析思路
思路總結(jié)：
1.基因集評分在單細(xì)胞中的廣泛應(yīng)用，很多文章都有自定義的基因集。
2.本篇文章巧妙的實驗設(shè)計，為早期LUAD多區(qū)域圖譜增加了很多內(nèi)容。
3.如何從分析結(jié)果中找到有意思的分析點？并通過多種方法論證推斷。
//主要結(jié)果
- 問題：早期LUAD的單細(xì)胞圖譜是怎樣的？
P1樣本單獨進(jìn)行scRNA分析，共得到15132個細(xì)胞，EPCAM+上皮細(xì)胞在三個不同位置的平均比例為4.2%。為了更好的描繪上皮細(xì)胞譜系，對P2-5樣本進(jìn)行流式分選，分為EPCAM+和EPCAM-，以富集上皮細(xì)胞，共得到186916個細(xì)胞，中值基因1844，上皮細(xì)胞比例37.6%。
相比于正常組織，增殖上皮細(xì)胞主要在LUAD中富集，而且EPCAM+細(xì)胞基因表達(dá)數(shù)目高于EPCAM-。層次聚類結(jié)果表明LUAD中細(xì)胞類型和正常組織轉(zhuǎn)錄差異明顯。對空間細(xì)胞組成的分析顯示，腫瘤鄰近程度越高，其拓?fù)涮荻仍矫黠@，這在所有患者中都是一致的，特別是在LUAD中，B細(xì)胞的比例增加，NK細(xì)胞的比例下降。
這些結(jié)果表明了早期LUAD在腫瘤微環(huán)境(TME)中的空間轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性。
- 問題：肺上皮細(xì)胞的空間差異和LUAD的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性如何？
上皮細(xì)胞進(jìn)一步細(xì)分為10個細(xì)胞類型。C9主要來自LUAD樣本，且CNVscore非常高。相對于來自腫瘤中間或遠(yuǎn)處正常位點的細(xì)胞，來自癌旁正常組織的細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄規(guī)律上與LUAD的細(xì)胞更相似。
肺泡分化層次已被證明參與肺腫瘤的體內(nèi)發(fā)展。在我們的隊列中，具有明確譜系特征的肺泡細(xì)胞(如AT1、AT2和肺泡祖細(xì)胞)在LUAD組織中消耗殆盡。通過擬時序分析發(fā)現(xiàn)了AT2向AT1分化的軌跡，而且NOTCH信號也在分化軌跡中逐漸增高。
C9進(jìn)一步細(xì)分，發(fā)現(xiàn)P2中的LUAD CNV score較低，因此對KRAS進(jìn)行突變檢測(5` scRNA，可以檢測到)，P2中29%的C9細(xì)胞攜帶KRAS G12D突變，和KRAS野生型細(xì)胞相比，高表達(dá)MUC5AC和LCN2等基因。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了KRAS驅(qū)動突變和細(xì)胞譜系的空間異質(zhì)性模式，這可能是KRAS突變LUAD生態(tài)特有的。
和P2不同，P3中C9存在大規(guī)模的染色體變異，主要分為4個cluster，C2-4變異較為明顯，且C4存在一處特異的CNV事件，可能處于P3 LUAD演化軌跡的后期，軌跡分析也證明了這一點。P5中C9分為7個不同的cluster，擬時序分析顯示C4到C1的分化軌跡。
- 問題：淋巴細(xì)胞重編程如何促進(jìn)腫瘤微環(huán)境？
淋巴細(xì)胞進(jìn)一步細(xì)分，共發(fā)現(xiàn)10個細(xì)胞類型，相對于正常組織，LUAD富含plasma(SDC1+/MZB1+)、B (CD19+/CD22+)和T regulatory(Treg;FOXP3 +)細(xì)胞。隨著腫瘤鄰近程度的增加，我們注意到NK(GNLY+)和 innate lymphoid cells(ILCs)， GZMA-hi和GNLY-hi的CD4+ cytotoxic T(CTL;CD40LG +,BATF+)和GNLY-hi CD8+ CTL逐漸降低，在LUAD中都被耗盡。
通過基因集評分，Naive CD8表現(xiàn)出高初始、低毒性特點。GNLY-hi CD8+ CTL高表達(dá)細(xì)胞毒性基因，但是在LUAD樣本中耗盡。CD8+ CTL顯示空間調(diào)節(jié)顯著降低細(xì)胞毒性標(biāo)記評分，并降低主要細(xì)胞毒性基因如NKG7和GNLY的表達(dá)，LUAD中這些基因表達(dá)都是最低的。
LUAD組織特異性富集FOXP3+ Tregs，Treg score隨著LUAD的距離而顯著增加。Tregs細(xì)胞也表達(dá)高水平的腫瘤免疫檢查點。共表達(dá)CTLA-4和TIGIT免疫檢查點的Tregs的比例沿著遠(yuǎn)端正常位點到更接近腫瘤區(qū)域逐漸升高，Treg score隨著LUAD的臨近而顯著增加。
分析plasma和B細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，吸煙者(P2和P3)的plasma比例明顯高于非吸煙者，TCGA的數(shù)據(jù)也證明了這一點。我們還鑒定了3種不同的B細(xì)胞亞群，包括一個LUAD富集的亞群(C0)，其高表達(dá)RAC2+和ACTG+，已知在B細(xì)胞突觸形成中起關(guān)鍵作用。與匹配的正常肺組織相比，B細(xì)胞signature(C0)在非典型腺瘤性增生(AAH)、LUAD的腫瘤前前體和侵襲性LUAD中逐漸增加，B細(xì)胞signature也與延長的總生存期(OS)和無進(jìn)展間期(PFI)相關(guān)。
- 問題：LUAD早期抗原提呈髓細(xì)胞的特點？
髓系細(xì)胞進(jìn)一步細(xì)分，發(fā)現(xiàn)隨著腫瘤鄰近程度的增加，M2-like macrophages C5、monocytes經(jīng)典和非經(jīng)典)和mast逐漸減少，而M2-like macrophages C1、 proliferating myeloid和cDC2細(xì)胞在腫瘤中穩(wěn)步富集。此外，我們發(fā)現(xiàn)，與主要富集在正常樣本中的C5 M2-like macrophages相比，C1 M2-like macrophages的抗原呈遞評分顯著降低，隨著LUAD的空間鄰近性增加，抗原提呈標(biāo)記基因的表達(dá)水平顯著降低。
三個cDC2亞群中，C1炎癥基因score最低，并在LUAD中大量富集。炎癥信號(高度富集于C2)和MHC II類基因(富集于C0/C1)的差異表達(dá)，此前已被證明可以區(qū)分炎癥性和非炎癥性cDCs。炎癥評分最高的cDC2亞群(C2)進(jìn)一步以空間上的炎癥標(biāo)志物評分為特征，隨著腫瘤鄰近程度的增加而顯著減弱。非炎癥性與炎癥性的得分在cDC2中相對較高在TCGA LUAD隊列中與OS和PFI延長相關(guān)。
- 早期LUAD的受配體互作特性
利用iTALK內(nèi)置數(shù)據(jù)庫針對 checkpoint-receptor、cytokine-receptor進(jìn)行計算分析和標(biāo)注。計算Jaccard index，發(fā)現(xiàn)與更近端(相鄰，中間)區(qū)域相比，腫瘤與遠(yuǎn)處正常組織之間的L-R相互作用重疊減少。我們發(fā)現(xiàn)，與它們各自的空間正常組織相比，LUADs中改變的細(xì)胞相互作用受到顯著和差異的調(diào)節(jié)。在細(xì)胞因子受體對中，LUADs顯示CX3CL1+腫瘤上皮細(xì)胞與表達(dá)其同源受體CX3CR1的DCs或巨噬細(xì)胞之間的交流增加。
值得注意的是，我們發(fā)現(xiàn)腫瘤上皮細(xì)胞上的免疫檢查點蛋白CD24或LGALS9 和巨噬細(xì)胞上的SIGLEC10或DC上HAVCR2之間的相互作用增強(qiáng)，并且在多個患者中共享。這些相互作用在與LUAD距離不同的腫瘤組織與正常組織中差異富集。CD24和LGALS9在LUAD組織的上皮細(xì)胞中表達(dá)水平總體上增加，特別是在惡性腫瘤富集的細(xì)胞簇中。這些發(fā)現(xiàn)表明，早期LUAD生態(tài)中存在細(xì)胞互作，使促腫瘤炎癥和免疫抑制狀態(tài)增加。
上述發(fā)現(xiàn)促使我們使用外部隊列來驗證CD24表達(dá)模式。我們發(fā)現(xiàn)該抗原在正常肺組織、AAHs和LUADs中的表達(dá)逐漸顯著增加。CD24與上皮marker EPCAM的表達(dá)以及促腫瘤和免疫抑制基因(TIGIT, CTLA4, FOXP3, CCL19)的水平呈正相關(guān)，而與抗腫瘤免疫標(biāo)記物(GZMB, GZMH, PRF1)負(fù)相關(guān)。使用早期LUAD內(nèi)部隊列，我們發(fā)現(xiàn)相對較高的CD24與縮短的OS和PFI相關(guān)。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在同基因小鼠模型中，通過CRISPR介導(dǎo)敲除Cd24a或使用中和抗體抑制Cd24a，顯著降低了小鼠LUAD細(xì)胞在體內(nèi)的生長。這些發(fā)現(xiàn)表明，在早期LUAD中，CD24是一個富集的細(xì)胞互作的核心，它與促腫瘤免疫環(huán)境和不良預(yù)后相關(guān)，并促進(jìn)LUAD在體內(nèi)的生長，相對較高的CD24與縮短的OS和PFI相關(guān)
