上個月，復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李琳課題組與董愛武、沈文輝課題組合作在PNAS發(fā)表題為“AtINO80 represses photomorphogenesis by modulating nucleosomedensity and H2A.Z incorporation in light-related genes”的研究論文，揭示了染色質(zhì)重塑子AtINO80參與植物光形態(tài)建成的分子機(jī)制。
研究背景
光是影響植物生理和發(fā)育過程最重要的外部信號之一。
在光照下，黃化（暗生長）幼苗開始光形態(tài)建成，導(dǎo)致下胚軸停止伸長、子葉開放和花青素/葉綠素的積累等深層形態(tài)的轉(zhuǎn)變。
光形態(tài)建成是連接光調(diào)控轉(zhuǎn)錄重編程和生物形態(tài)變化的重要發(fā)育進(jìn)程。
越來越多的證據(jù)表明，染色質(zhì)重塑子，作為轉(zhuǎn)錄輔助因子參與光形態(tài)和暗形態(tài)建成。然而，組蛋白變異體的摻入/排除調(diào)節(jié)光形態(tài)建成反應(yīng)的機(jī)制尚不清楚。
- IF=9.412
- 技術(shù)：ChIP-seq+RNA-seq
文章思路
- 發(fā)現(xiàn)光形態(tài)調(diào)節(jié)因子AtINO80
- RNA-seq研究AtINO80對轉(zhuǎn)錄組的影響
- ChIP-seq研究AtINO80調(diào)控機(jī)制
- 進(jìn)一步研究AtINO80調(diào)控的關(guān)鍵基因
文章結(jié)果
1. AtINO80是光形態(tài)建成的抑制因子
atino80-5 和atino80-6 突變體是AtINO80（依賴ATP的染色質(zhì)重塑子INOSITOL REQUIRING80 （INO80））功能缺失突變等位基因。
作者比較了在紅光、白光、藍(lán)光或遠(yuǎn)紅光下生長時這些突變體與野生型Col-0的表型。用顯微鏡測量了下胚軸伸長區(qū)的細(xì)胞長度，發(fā)現(xiàn)，AtINO80通過促進(jìn)下胚軸細(xì)胞伸長和抑制花青素的積累而作為光形態(tài)建成的抑制因子。
2. 光照對AtINO80的調(diào)節(jié)作用
光敏色素和隱花色素光受體，都促進(jìn)了光介導(dǎo)的AtINO80表達(dá)抑制。
通過免疫印跡分析，評估35S::AtINO80- Flag轉(zhuǎn)基因株系和pEYFP-AtINO80-G轉(zhuǎn)基因幼苗中AtINO80蛋白水平。發(fā)現(xiàn)光照可以抑制AtINO80mRNA的表達(dá)，但可以增加AtINO80蛋白的水平。
3. 光照和黑暗條件下AtINO80對轉(zhuǎn)錄組的影響（RNA-seq）
首先，通過RNA-seq，比較長日照條件下生長的atino80-5和Col-0的植株，將得到的差異基因與幼苗從黑暗轉(zhuǎn)到光照條件下發(fā)現(xiàn)的5080個光誘導(dǎo)基因進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)了 大量的重疊（P <0.001） 。并對每組基因進(jìn)行 GO分析，表明光誘導(dǎo)基因，特別是AtINO80上調(diào)的基因，可能促進(jìn) atino80 植物的光形態(tài)建成。
同時，作者比較了黑暗生長的atino80-6與Col-0 幼苗，將得到DEGs與4468個暗誘導(dǎo)基因進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞伸長相關(guān)的基因，可能有助于減少*atino80 *的暗形態(tài)建成。
4. atino80中H3水平和H2A.Z占有率的變化（ChIP-seq）
為了研究AtINO80是如何調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄水平，使用組蛋白H2A.Z和組蛋白H3的抗體在長日生長的Col-0和atino80-5中進(jìn)行ChIP-seq。
在Col-0中獲得組蛋白H2A.Z約18,649個peak（19,488個基因），與已發(fā)表的組蛋白H2A.Z有很大重疊（79%）。如圖2A和B所示，與前人發(fā)表的數(shù)據(jù)一致，組蛋白H2A.Z的peak分布在靠近TSS的整個genebody區(qū)。在atino80-5突變體中，組蛋白H2A.Z水平在整個gene body區(qū)域降低。
此外，組蛋白H3在atino80-5中的占有率也發(fā)生了變化。
把input作為對照，分別鑒定了7803個和2147個差異富集的組蛋白H2A.Z和H3修飾。
早前在長日生長的atino80-5中發(fā)現(xiàn)的DEG與組蛋白H2A和H3差異富集的基因顯著重疊，表明atino80的功能與組蛋白H2A、Z和H3的修飾水平密切相關(guān)。兩組重疊基因富集在光相關(guān)的GO terms。
此外，光誘導(dǎo)基因與組蛋白H2A.Z和組蛋白H3差異富集基因有顯著重疊。組蛋白H2A.Z標(biāo)記可能受組蛋白H3占有率變化的影響，因為組蛋白H3差異富集基因和組蛋白H2A.Z差異富集基因之間存在大量重疊（P<0.001）。為此，把組蛋白H3作為input，對組蛋白H2A.Z進(jìn)行差異分析，對所有組蛋白H2A.Z富集區(qū)域進(jìn)行差異富集分析。在atino80-5中，鑒定到了2300個組蛋白H2A.Z減少的區(qū)域和2042個組蛋白H2A.Z增加的區(qū)域。atino80-5中上調(diào)的DEGs在組蛋白H2A.Z降低的基因中顯著過表達(dá)，而下調(diào)的DEGs在組蛋白H2A.Z升高的基因中顯著過表達(dá)。表明組蛋白H2A.Z的占有率與AtINO80調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄呈負(fù)相關(guān)，這與最近的報道一致。
5. AtINO80調(diào)控光相關(guān)基因的機(jī)制
接下來，作者將重點放在光響應(yīng)基因上，以確定組蛋白H2A.Z、H3的變化程度，以及組蛋白H2A.Z/H3在光和AtINO80轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的比例。觀察到重疊基因中組蛋白H2A.Z/H3減少（P<0.05，），與Col-0相比，atino80-5中上調(diào)的基因更為明顯（P<0.001）。然而，在光和AtINO80調(diào)控基因重疊基因群中，組蛋白H2A.Z/H3修飾的降低并不顯著（P =0.81）。
作者追蹤了特定基因中H2A.Z和H3組蛋白的水平。組蛋白H2A.Z和H3在HY5、HYH、SPT、NIA2、FLS1和EFR11 gene body富集減少可能導(dǎo)致它們在atino80中的轉(zhuǎn)錄水平升高。值得注意的是，AtINO80增加了組蛋白H2A.Z、H3和H2A.Z/H3在HY5 gene body的富集，從而抑制了HY5的表達(dá)。HY5是幼苗光形態(tài)建成過程中的一個關(guān)鍵調(diào)控因子，調(diào)控多種基因的轉(zhuǎn)錄。因此，AtINO80對上述基因表達(dá)的影響可能是通過改變組蛋白H2A.Z水平和核小體密度來控制HY5的轉(zhuǎn)錄的結(jié)果。
最近發(fā)表的一篇論文表明，HY5的主要活性是通過直接靶向127個基因來促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的。在長日生長的atino80-5中鑒定出的DEGs與這些直接的HY5靶基因有顯著的重疊（P<0.001）。AtINO80對這些重疊的HY5靶基因表達(dá)的作用可能是由于組蛋白H2A.Z和H3水平的降低，比如RGA-LIKE3（RGL3）,microRNA 163（miR163）,* RESPONSIVE
TODESICCATION26（RD26）, At1g25400和CYS, MET, PRO,AND GLY PROTEIN1（CMPG1），也可能是HY5水平增加的結(jié)果，比如對于At4g32480, BTB AND TAZ DOMAIN PROTEIN 5（BT5）, MYB44, At4g38825和REDUCED
EPIDERMAL FLUORESCENCE5（REF5）* 基因。
綜上所述，AtINO80在光調(diào)節(jié)基因表達(dá)中的作用可能是通過改變核小體密度和組蛋白H2A.Z水平直接調(diào)控的，也可能是通過其下游基因*HY5 *間接調(diào)控的。
