系列筆記基于達澈生物講座視頻，從中初步學習了解生信分析中常遇到的組學分析技術(shù)。
ChIP-seq和 CUT&Tag、CUT&RUN講座視頻筆記 - 簡書
ATAC-seq講座視頻筆記 - 簡書
CLIP、RIP-seq講座視頻筆記 - 簡書
Ribo-seq講座視頻筆記 - 簡書
RIC-seq講座視頻學習 - 簡書
(eccDNA)circle-seq講座視頻學習 - 簡書

1、背景

1.1、RNA的特征

簡略介紹下RNA的相關(guān)知識，感興趣可深入查閱教材、文獻等

• RNA有著多種多樣的功能，可在遺傳編碼、翻譯、調(diào)控、基因表達等過程中發(fā)揮作用；通常由DNA經(jīng)由轉(zhuǎn)錄生成。
• 其中，mRNA（信使RNA）為遺傳訊息的傳遞者，它能夠指導蛋白質(zhì)的合成。

中心法則

• 因為mRNA有編碼蛋白質(zhì)的能力，它又被稱為編碼RNA。而其他沒有編碼蛋白質(zhì)能力的RNA則被稱為非編碼RNA（ncRNA），主要包括tRNA與rRNA
• 相比DNA，RNA最大的區(qū)別有：單鏈，較短，由于存在互補序列通過折疊形成雙鏈接構(gòu)。

image from wiki

• RNA結(jié)合蛋白(RNA-binding proteins,RBPs) 對RNA功能具有重要作用，例如RNA運輸、可變剪切，翻譯等等；具體可以見wiki的介紹

  
  
  image from wiki

• RNA修飾(RNA modification)是指對RNA核糖核酸化學結(jié)構(gòu)的改變（通常是接了一些基團），可能會改變其功能或穩(wěn)定性。
  以下圖m7G為例就是指在RNA鳥嘌呤(G)的第七位N上加上甲基的甲基化修飾

  
  
  common RNA modification

1.2、CLIP、RIP-seq

• CLIP、RIP-seq兩種技術(shù)，我覺得就可以簡單理解為RNA版本的ChIP-seq

  
  
  encode
• 即主要研究特定RNA binding protein（RBP）在RNA上的分布以及RNA特定修飾的情況。從而達到以下目的--
  （1）驗證RNA與靶蛋白的直接相互作用及精確的結(jié)合位點；
  （2）在全基因組范圍內(nèi)鑒定RNA與RBP的相互作用網(wǎng)絡；
  （3）lncRNA/circleRNA功能機制研究以及miRNA靶標鑒定。

也可以檢測出RNA間的相互作用（例如lncRNA與miRNA）

• 下面就簡單了解下這兩種技術(shù)。

2、Clip-seq

• ultraviolet cross-linking and immunoprecipitation 紫外交聯(lián)，免疫沉淀（2003年）
• 特征之一就是使用紫外交聯(lián)方式，RNA與附著的蛋白（RBP）以共價鍵形式綁在一起，用于研究RNA結(jié)合蛋白在體內(nèi)與眾多RNA靶標（片段）的結(jié)合模式。

實驗步驟

參考下圖

• 1~2：紫外照射，使RNA與蛋白之間形成共價結(jié)合；然后降解RNA非蛋白結(jié)合區(qū)域；
• 3：使用RBP對應的特異性抗體，捕捉目標蛋白RNA復合物
• 4~5：RNA兩端修飾
• 6~9：富集、純化、去蛋白，再修飾、純化
• 10~11：反轉(zhuǎn)錄、加接頭，PCR建庫
• 12：測序

image from 達澈生物

clip with RNA modification

升級過程

自2003年提出clip方法以來，出現(xiàn)很多改進的版本

（1）iclip 2010年

• individual-nucleotide resolution UV cross-linking and immunoprecipitation；
  能夠以單堿基的分辨率，來展示RNA-蛋白互作的詳細信息
• 關(guān)鍵技術(shù)在于中間的 cDNA環(huán)化

（2）eclip 2015年

• enhanced clip
  相比clip-seq，RBPs靶標識別率提高了2-3倍
• 不同之處主要體現(xiàn)在RNA文庫制備步驟
  在免疫沉淀的磁珠上添加一個3'RNA接頭用于和RNA片段交聯(lián)；并且添加一個3'單鏈DNA接頭用于反轉(zhuǎn)錄之后交聯(lián)

（3）hiclip 2017年

• hybrid and individual-nucleotide resolution UV cross-linking and immunoprecipitation；
  在全轉(zhuǎn)錄組水平上鑒定與RBP結(jié)合的特定RNA復合體的方法
• 特征之一：若rbp同時結(jié)合兩個rna鏈，均可以捕獲出來；
  通過連接酶將雙鏈RNA的兩端壁進行連接

2、RIP-seq

• RNA immunoprecipitation sequencing
• 通過免疫沉淀目標蛋白來捕獲蛋白體內(nèi)結(jié)合的RNA（基本類似chip-seq）
• 即主要利用能夠特異識別某一RBP或者某一RNA修飾的抗體；

實驗步驟（以m6A-MeRIP-seq為例）

參考下圖

• 首先提取total RNA，將RNA片段化（100nt左右）
• 使用帶有m6A抗體的免疫磁珠對發(fā)生m6A甲基化修飾的RNA片段進行富集；
• 然后純化富集到的RNA片段；
• 最后上機測序。

image from wiki

RIP with RBPs

關(guān)于RIP與clip-seq的比較

image.png

3、數(shù)據(jù)分析

• 基本流程分析還是類似于chip-seq；
• 數(shù)據(jù)質(zhì)控→ 找peak → peak 分析；
• 新的研究思路還是需要閱讀相關(guān)文獻。

image from 達澈生物

image from 達澈生物

最后推薦一個研究RNA結(jié)構(gòu)的必備網(wǎng)站：ENCORI，里面有很多公共clip-seq數(shù)據(jù)等