系列筆記基于達(dá)澈生物講座視頻，從中初步學(xué)習(xí)了解生信分析中常遇到的組學(xué)分析技術(shù)。
ChIP-seq和 CUT&Tag、CUT&RUN講座視頻筆記 - 簡書
ATAC-seq講座視頻筆記 - 簡書
CLIP、RIP-seq講座視頻筆記 - 簡書
Ribo-seq講座視頻筆記 - 簡書
RIC-seq講座視頻學(xué)習(xí) - 簡書
(eccDNA)circle-seq講座視頻學(xué)習(xí) - 簡書
0、總綱
- ChIP-seq是探究有特定蛋白結(jié)合的DNA片段，即蛋白與DNA特定區(qū)域的互作關(guān)系；
-
CUT&RUN、CUT&TAG是近些年提出的兩個(gè)更高效的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。
image from ENCODE
1、ChIP-seq（Chromatin Immuno-Precipitation）
染色體免疫共沉淀反應(yīng)
1.1 上游實(shí)驗(yàn)原理
A 實(shí)驗(yàn)步驟
參考下圖，主要分為5步
（1）甲醛交聯(lián)
- 將目標(biāo)蛋白（根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩ǎ┚o密綁定到其可以與DNA連接的位置上；
- 目標(biāo)蛋白是我們感興趣的蛋白，例如有特定修飾的組蛋白；
- 我想就是為避免下一步超聲時(shí)脫離；
（2）超聲打斷
- 將所有DNA打斷成一定長度的小片段；
-
所有片段可分為兩大類：有特定蛋白結(jié)合的，無特定蛋白結(jié)合的
5 steps of ChIP-seq
（3）片段富集
- 根據(jù)目標(biāo)蛋白，添加特異抗體，形成抗體與目標(biāo)蛋白免疫沉淀復(fù)合物；
- 然后用磁珠分離富集
（4）文庫構(gòu)建
- 去交聯(lián)，純化DNA；
- 加接頭，擴(kuò)增
（5）測序
- illumina二代測序
B 技術(shù)難點(diǎn)
（1）實(shí)驗(yàn)步驟較多，參數(shù)設(shè)置優(yōu)化
- 例如交聯(lián)、超聲等參數(shù)設(shè)置需要實(shí)驗(yàn)摸索；
- 整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期大概三天左右。
（2）抗體選擇
- 對(duì)于任何一種特定的靶抗原，都有不止一種有效抗體；
-
如何篩選高質(zhì)量的抗體是很重要的（因?yàn)椴蛔鰧?shí)驗(yàn)，就不細(xì)述了）
磁珠對(duì)蛋白免疫沉淀復(fù)合物的富集.png
（3）結(jié)果解讀
chip-seq的結(jié)果有時(shí)存在背景高、非特異性的peak的缺點(diǎn)；即目標(biāo)DNA片段分布不是很集中。原因可能如下
- 甲醛過度交聯(lián)導(dǎo)致蛋白與非目標(biāo)DNA位置結(jié)合；
- 非特異性DNA與Bead直接結(jié)合（solution：可用Salmon Sperm DNA封閉）；
- 抗體特異性不強(qiáng)；
- ........
C 對(duì)照設(shè)計(jì)
（1）input對(duì)照（必做）
即相同實(shí)驗(yàn)條件下，進(jìn)行到第二步超聲打斷的結(jié)果。目的主要是
-
可以驗(yàn)證DNA斷裂的效果（片段長度分布）
sonication超聲 - 可根據(jù)input中靶序列的含量以及染色質(zhì)沉淀中的靶序列含量，按照取樣比例換算出CHIP的效率；
（2）陽性對(duì)照（選做）
主要目的是驗(yàn)證chip-seq實(shí)驗(yàn)理論上有目標(biāo)蛋白結(jié)合就會(huì)出現(xiàn)peak的
- 一般使用anti-RNA PolymeraseⅡ抗體；
- 因?yàn)樵摽贵w是通用轉(zhuǎn)錄因子，在所有細(xì)胞中都能結(jié)合基因的核心啟動(dòng)子區(qū)。因此理論上chip后都會(huì)有條帶。
（3）陰性對(duì)照（選做）
主要目的是驗(yàn)證chip-seq實(shí)驗(yàn)理論上沒有目標(biāo)蛋白結(jié)合就會(huì)不出現(xiàn)peak的
- 一般用普通的IgG抗體
陽性、陰性對(duì)照的例圖可見筆記最后
1.2 下游數(shù)據(jù)分析
參考下圖，chip-seq的數(shù)據(jù)分析常規(guī)流程如下
（1）RAW data→Clean data
- 質(zhì)控（QC）；
- 去接頭(cutadapt)
（2）Alignment
- bwa、bowties等biosoft，重點(diǎn)關(guān)注mapping rate
- visualization(deepTools/IGV)
（3）Peakcalling
- ChIP-seq的必做步驟，研究蛋白bindinng的DNA片段相對(duì)集中區(qū)域
- MACS2軟件，之前的關(guān)于MACS筆記見鏈接
-
根據(jù)peak分布結(jié)果可進(jìn)一步嘗試motif analysis(Homer)，gene annotation(Homer)→GO/KEGG(R)，并且聯(lián)和RNA-seq DEG、ATAC-seq等
image from 達(dá)澈生物
2、CUT&RUN、CUT&TAG
- ChIP-seq主要用超聲打斷的方式切割DNA片段，
- 近些年出現(xiàn)的CUT&RUN、CUT&TAG則主要利用酶切的方式
2.1 cut&run
cleavage under targets and release using nuclease
大致步驟如下
- （1）抗體結(jié)合綁在DNA上的靶向蛋白；
- （2）Protein A-MNase酶復(fù)合物與抗體交聯(lián)；
MNase酶為DNA內(nèi)切酶，可切斷所識(shí)別到的DNA片段
- （3）鈣離子激活MNase酶，剪下目標(biāo)蛋白所連的目標(biāo)DNA片段；
- （4）蛋白復(fù)合物富集
2.2 cut&tag
cleavage under targets and tagmentation
大致步驟如下
- (1) 一抗結(jié)合目標(biāo)蛋白，二抗結(jié)合一抗(信號(hào)放大)；
- (2) 加入protein A-Tn5酶復(fù)合物
Tn5酶是轉(zhuǎn)座酶，ATAC實(shí)驗(yàn)常用，完成剪切、粘貼的作用；
- 剪下目標(biāo)蛋白所連接的目標(biāo)DNA片段，并在兩邊加上接頭（建庫更方便）
2.3 相比于ChIP-seq的優(yōu)勢
- 實(shí)驗(yàn)材料(細(xì)胞)使用量少，適合珍貴樣品；
- 不需要超聲打斷，因此也可不做甲醛固定（前提是新鮮細(xì)胞）；
- 實(shí)驗(yàn)周期短，兩天左右；
- 數(shù)據(jù)背景信號(hào)非常低！可參考一篇paper的比較
