? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 利用黃熱病病毒復(fù)制子構(gòu)建SARS-CoV-2? ?repRNA疫苗及其檢測
由嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型(SARS-CoV-2)感染引起的2019冠狀病毒病(COVID-19)大流行是一種全球性威脅。SARS-CoV-2的主要傳播途徑包括咳嗽、打噴嚏和呼吸道飛沫以及氣溶膠等。癥狀輕的患者可在10天后康復(fù)，而嚴重者因肺泡損傷而出現(xiàn)間歇性呼吸衰竭導致死亡，因此為了預(yù)防大流行，開發(fā)安全有效的疫苗是極有必要的。
2022年，日本科學家在國際知名科學期刊PLOS ONE上發(fā)表了題為“Construction and evaluation of a selfreplicative RNA vaccine against SARS-CoV-2 using yellow fever virus replicon”的文章，該研究將編碼SARS-CoV-2刺突(S)蛋白的基因插入到黃熱病病(YFV)毒株復(fù)制子中，構(gòu)建并檢測了一種repRNA疫苗，復(fù)制子RNA (repRNA)是一種安全、有效的疫苗，該疫苗不僅編碼抗原基因，還編碼RNA復(fù)制所需的基因并且自我復(fù)制，因此可以引起強大的免疫力。
在本研究中，作者在YFV復(fù)制子中構(gòu)建了含有SARS-CoV-2?（S）蛋白編碼區(qū)的repRNA疫苗（圖1A），同時也構(gòu)建了non-repRNA疫苗（圖1B）。
采用NEPA21?(Nepagene)?電穿孔器將repRNA和non-repRNA疫苗電穿孔至幼鼠腎細胞(BHK)。轉(zhuǎn)染后48?小時，通過western blotting法證實S蛋白在BHK細胞中的表達，同時免疫熒光法證實S蛋白與YFV蛋白共表達。作者采用了Real-time RT-PCR驗證repRNA疫苗在BHK細胞中的自我復(fù)制能力。然后對6周齡雌性C57BL/6小鼠分別于第0、28、56天經(jīng)腹腔注射repRNA疫苗、non-repRNA疫苗各1μg，同時利用NEPA21電穿孔器向小鼠大腿處提供電脈沖，增強RNA疫苗的遞送。然后通過ELISA法檢測了sars - cov - 2s的igg抗體以及YFV非結(jié)構(gòu)蛋白1 (NS1)抗體水平。此外，作者制備了S蛋白假型熒光素酶報告慢病毒作為評價小鼠體液免疫的工具，為了驗證YFV復(fù)制子骨干系統(tǒng)和體內(nèi)RNA電穿孔免疫的充分性，構(gòu)建了DENV含有包膜(E)基因的YFV復(fù)制子，并采用與SARS-CoV-2 repRNA疫苗基本相同的方法進行了評估。第三次接種后20天，從小鼠身上分離脾臟淋巴細胞。利用這些脾細胞，采用單色酶聯(lián)免疫吸附斑點法(IMMUNOSPOT)進行酶聯(lián)免疫吸附斑點(ELISpot)檢測。
通過上述一系列實驗，成功生成了一種編碼repRNA疫苗的DNA質(zhì)粒，該質(zhì)粒在YFV復(fù)制子中含有S蛋白的外結(jié)構(gòu)域（圖1A）。western blotting法證實了repRNA和non-repRNA在細胞內(nèi)表達S蛋白(圖2A)，但repRNA表達的S蛋白明顯高于non-repRNA, non-repRNA幾乎檢測不到S蛋白(圖2B)。此外，利用實時RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染細胞中RNA水平的動力學，以探究repRNA疫苗的自我復(fù)制能力。在轉(zhuǎn)染后24-96小時，與未轉(zhuǎn)染repRNA疫苗的細胞相比，轉(zhuǎn)染repRNA疫苗的細胞中RNA水平顯著升高(圖2D)。這些數(shù)據(jù)表明，repRNA疫苗構(gòu)建成功且具有自我復(fù)制能力，證明了其疫苗效力。
為了進一步研究細胞免疫的誘導作用，在第三次免疫后20天采集接種SARS-CoV-2小鼠的脾細胞，并進行ELISpot檢測。在實驗?zāi)Ｐ椭?，repRNA疫苗的免疫水平雖然有限，但與non-repRNA疫苗相比，它在小鼠體內(nèi)誘導了t細胞應(yīng)答(圖3)。
本實驗中，研究人員借助 NEPA21電穿孔器卓越的基因?qū)牍δ芡瓿闪薘NA疫苗導入到小鼠的腎細胞中，以及對小鼠進行腿部肌肉電轉(zhuǎn)提高RNA疫苗的轉(zhuǎn)染效果，為實驗成功錦上添花。該研究證實所制備的repRNA疫苗能夠在體外表達S蛋白并具有自我復(fù)制能力。該疫苗在小鼠體內(nèi)并沒有強有力地誘導體液免疫，可能是由于S蛋白表達較低，盡管如此，還是有對S蛋白產(chǎn)生特異性t細胞反應(yīng)的傾向。同時在誘導t細胞活化程度方面，repRNA疫苗顯著高于non-repRNA疫苗，證實了repRNA作為疫苗的有效性。然而，為了提高repRNA疫苗的免疫誘導能力，后續(xù)還需要進一步優(yōu)化疫苗給藥方式，提高S蛋白的表達。
文獻信息
（1）原文鏈接：
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0274829
（2）參考文獻：
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5、百度百科
文章來源：艾貝泰細胞
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