01一、文章信息

發(fā)表雜志名稱：Cancer Cell

中文標題：感官神經元通過谷氨酸能神經元 - 癌癥偽突觸驅動胰腺癌進展

英文標題：Sensory neurons drive pancreatic cancer progression through glutamatergic neuron-cancer pseudo-synapses

影響因子：44.5

發(fā)表日期：2025 年 9 月 25 日

01二、研究概述
Ren 等人的研究證實了感官神經元與胰腺導管腺癌（PDAC）細胞之間存在偽突觸連接。這些偽突觸中，NMDA 受體亞基 GRIN2D/GluN2D 富集，增強了 PDAC 細胞對神經元來源谷氨酸的反應，進而促進腫瘤生長。在 PDAC 模型中，破壞偽突觸處的谷氨酸 - GRIN2D 信號可改善小鼠生存狀況，這一發(fā)現(xiàn)凸顯了靶向癌癥 - 神經元偽突觸的治療潛力。此外，研究還揭示了感官神經支配通過 TGFA-EGFR 信號的前饋環(huán)路調控 PDAC 細胞中 Grin2d 的上調，以及 Grin2d 在腫瘤生長、神經浸潤等過程中的關鍵作用，為癌癥神經科學指導的腫瘤治療提供了新方向。

01三、研究結果

（一）GRIN2D 在 PDAC 中的表達及其功能意義

作者首先分析了患者來源的 PDAC 腫瘤活檢樣本和相應人腹腔神經節(jié)標本中谷氨酸受體亞型的表達，并擴展到 TCGA 數(shù)據庫中的人 PDAC 組織，發(fā)現(xiàn) GRIN2D 基因（NMDAR 家族成員）表達顯著升高（圖 1A、1B）。與正常胰腺相比，PDAC 中 GRIN1、GRIN2A 和 GRIN2D 表達均升高，且僅 GRIN2D 與 TNM 分期中的 T 期和 N 期顯著相關（圖 S1A、S1B、S1C）。在多種人類癌癥中，GRIN2D 表達也高于正常組織（圖 S1D），且在人 PDAC 樣本中，GRIN1 和 GRIN2D 在 NMDAR 組件中存在顯著共表達和相關性（圖 S1E）。在人神經親和性 SU.86.86、T3M4 細胞系和非神經親和性 Panc-1、Capan-1 細胞系，以及小鼠神經親和性 TPAC 細胞系和非神經親和性 KPC 細胞系中，GRIN2D 在 NMDAR 亞型中表達最高，且與 GRIN1 共表達（圖 S1F-S1K）。

通過對兩個單細胞 RNA 測序數(shù)據集（70 個人 PDAC 腫瘤的 325,480 個細胞）分析，作者發(fā)現(xiàn) GRIN2D 選擇性富集在惡性上皮細胞中，在非惡性群體中表達極少（圖 1C、1D、S2A-S2D），且未接受治療的腫瘤中 GRIN2D 表達高于接受 FOLFIRINOX 治療且應答不佳的腫瘤（圖 S2E）。

為評估 L - 谷氨酸（GRIN2D 亞基的配體）的影響，作者測試了不同濃度 L - 谷氨酸對細胞的作用，發(fā)現(xiàn) 0.5μM L - 谷氨酸能最佳刺激癌細胞中 GRIN2D 轉錄，且不影響細胞生長（圖 S2F-S2L）。神經親和性細胞系 SU.86.86、T3M4、TPAC 在 L - 谷氨酸和 DRG 條件培養(yǎng)基（CM）處理下，遷移和侵襲能力增強，而非神經親和性細胞 Panc-1、Capan-1、KPC 則無此變化（圖 1E-1G）。用 GRIN2D 選擇性拮抗劑 UBP145 預處理，可逆轉 SU.86.86、T3M4、TPAC 細胞的遷移和侵襲行為，但對非神經親和性細胞系無影響（圖 1H、1I、S2M）。在 SU.86.86 和 Capan-1 細胞中沉默 GRIN2D（siGRIN2D），也產生了與 UBP145 類似的抑制效果，尤其在神經親和性 SU.86.86 細胞中（圖 1J-1L）。

綜上，本部分結果表明 L - 谷氨酸通過 NMDAR 亞型 GRIN2D 增強了神經親和性 PDAC 細胞的遷移表型。

（二）PDAC 中 GRIN2D/NMDAR 通路組件的檢測

作者通過 RT-qPCR 檢測了人 SU.86.86、Capan-1 細胞和小鼠 TPAC、KPC 細胞中 9 個谷氨酸轉運體基因的水平，發(fā)現(xiàn)除人細胞中 SLC1A3 和小鼠細胞中 Slc7a11 表達較高外，其他轉運體基因表達水平相當且較低，且 Western blot 分析顯示 SLC1A3、SLC7A11 和 SLC17A6（突觸小泡谷氨酸裝載關鍵蛋白）在這些細胞系中含量極低（圖 S3A-S3C）。

作者發(fā)現(xiàn)人 PDAC 組織中 GRIN2D 和 GRIN1 共表達且水平高于正常胰腺組織（圖 S3D、S3E），進一步研究顯示，在侵犯神經的癌細胞中，GRIN2D、GRIN1 和 DLG4 蛋白顯著富集，而在未參與神經侵犯的癌細胞中則無此現(xiàn)象（圖 2A）。同時，被癌細胞侵犯的神經中，VAMP1（突觸小泡相關膜蛋白 1）和 SLC17A6（囊泡谷氨酸轉運體 2）水平顯著高于未被侵犯的神經（圖 2B）。

DRG 條件培養(yǎng)基（CM）處理后，神經親和性 SU.86.86、T3M4、TPAC 細胞中 GRIN1（Grin1）和 GRIN2D（Grin2d）表達上調，而非神經親和性細胞中 GRIN1 和 GRIN2D mRNA 表達顯著降低（圖 S3）。Western blot 分析顯示，DRG CM 處理顯著增加人神經親和性癌細胞系（尤其是 SU.86.86 細胞）中 GRIN2D、GRIN1 和 DLG4 的蛋白表達，而非神經親和性 Panc-1 和 Capan-1 細胞中這些蛋白水平未改變或降低（圖 S3F-S3H）。免疫細胞化學分析顯示，在 SU.86.86-DRG 共培養(yǎng)物中，癌細胞中 GRIN2D、GRIN1、DLG4 和神經元中 VAMP1、SLC17A6 表達顯著，而在 Capan1-DRG 共培養(yǎng)物中表達不明顯（圖 2C、2D）。與 DRG 共培養(yǎng)可提高神經親和性 SU.86.86 和 T3M4 細胞中 GRIN1、GRIN2D 和 DLG4 的蛋白表達，但對非神經親和性 Panc-1 和 Capan-1 細胞無此作用（圖 S3I、S3J）。在 SU.86.86 細胞中敲除 GRIN2D 基因，可逆轉上述效應并影響 GRIN1 和 DLG4 的誘導表達，而在 Capan-1 細胞中未觀察到這種情況（圖 S3K）。

綜上，本部分結果表明癌細胞中特定 NMDAR 亞基（尤其是 GRIN2D）的表達伴隨著神經元中突觸前谷氨酸轉運蛋白的表達。

（三）L - 谷氨酸通過 CAMK IV-CREB 通路和 E2F1 介導的 EZH2 激活觸發(fā) GRIN2D 表達

利用 ARCHS4 數(shù)據庫，作者發(fā)現(xiàn) Zeste 2 多梳抑制復合物 2 亞基增強子（EZH2）是調控人細胞中 GRIN2D 表達的最潛在重要轉錄因子（TF）。在 TCGA 數(shù)據集中，人 PDAC 細胞中僅 GRIN1 和 GRIN2D 與 EZH2 表達共表達且呈正相關（圖 S4A、S4B）。染色質免疫沉淀 PCR（ChIP-PCR）實驗發(fā)現(xiàn) GRIN2D 基因區(qū)域內有兩個潛在的 EZH2 結合位點（圖 S4C），且 SU.86.86 細胞經 L - 谷氨酸處理后，EZH2 與 GRIN2D 的結合富集增加（圖 3A）。L - 谷氨酸處理后，僅神經親和性人 PDAC 細胞中 GRIN2D 和 EZH2 水平同步升高，非神經親和性 PDAC 細胞中無此效應（圖 S4D）。免疫細胞化學分析顯示，L - 谷氨酸和 DRG CM 均能上調 SU.86.86 細胞中 EZH2 水平，但對 Capan-1 細胞無此作用（圖 3B）。在 EZH2 siRNA 沉默組中，經 L - 谷氨酸和 DRG CM 處理后，GRIN2D 水平顯著降低（圖 3C、3D）。

已知 E2F 轉錄因子 1（E2F1）是 EZH2 表達的關鍵轉錄因子，作者發(fā)現(xiàn) SU.86.86 細胞中沉默 E2F1 后，E2F1 在 EZH2 啟動子處的富集顯著減少（圖 3E），且鑒定出 EZH2 啟動子上三個相應的 E2F1 結合位點（圖 S4E）。siRNA 介導的 E2F1 沉默后，SU.86.86 細胞中 EZH2 表達顯著下調（圖 3F）。

作者進一步研究 EZH2-E2F1 信號通路對 GRIN2D 的調控作用，發(fā)現(xiàn) SU.86.86 細胞經 L - 谷氨酸或 DRG CM 處理后，EZH2-E2F1 軸信號分子（EZH2、H3K27me3、pRB Ser780、E2F1、CyclinD1、CDK4）蛋白水平升高，而 CDKN2A 表達降低，Capan-1 細胞中這些蛋白表達無差異（圖 3G、S4F-S4H）。L - 谷氨酸處理使 SU.86.86 細胞中 EZH2 和 H3K27me3 水平升高、CDKN2A 表達降低，而轉染 EZH2 siRNA 可逆轉 CDK2NA 和 H3K27me3 的表達變化（圖 S4I）。此外，siRNA 下調 EZH2 可導致經 L - 谷氨酸和 DRG CM 處理的 SU.86.86 細胞中 E2F1 和 pRB Ser780 減少（圖 S4J）。

已知谷氨酸（尤其是配體刺激的 NMDAR 激活）會觸發(fā)神經元鈣內流，進而啟動下游鈣 / 鈣調蛋白依賴性蛋白激酶 4（CAMK4）通路，且 EZH2 表達受 Ser133 磷酸化的環(huán)磷酸腺苷反應元件結合蛋白 1（CREB1）正調控。作者發(fā)現(xiàn) SU.86.86 細胞經 L - 谷氨酸處理后，CAMK4 和 pCREB1 Ser133 同步激活（圖 S4K），而 CAMK4 沉默后，這些變化被消除，且谷氨酸依賴性 EZH2 水平降低（圖 3H、S4L）。

通過神經元 - 癌細胞共培養(yǎng)中的鈣成像記錄，作者證實人 SU.86.86 細胞中存在功能性含 GRIN2D 的 NMDA 受體，谷氨酸誘導的反應呈劑量依賴性，且可被特定 NMDA 受體拮抗劑（如 UBP141 和 AP5）調節(jié)，胰腺癌細胞靜息膜電位為 - 50.07±3.33mV（圖 3I-3L、S4M）。單獨培養(yǎng)的 SU.86.86 細胞無此反應，表明神經元與癌細胞的物理接近 / 接觸對胰腺癌細胞中 GRIN2D 信號的正常運作至關重要（圖 3M）。此外，SU.86.86 細胞與神經元共培養(yǎng)時，在無外部刺激情況下出現(xiàn)自發(fā)性鈣內流，該活動主要依賴 L 型和 T 型鈣通道而非 L - 谷氨酸，提示 GRIN2D 可能作為谷氨酸 “傳感器”，偽突觸處癌細胞的鈣內流可能由感覺神經元激活誘導（圖 S4N）。作者還證實，外源性應用 NMDA 可特異性激活共培養(yǎng)小鼠 DRG 神經元的 SU.86.86 細胞上的 Ca2?電流，單獨培養(yǎng)的 SU.86.86 細胞無此反應（圖 S4O、S4P）。

（四）小鼠胰腺癌細胞中的 Grin2d 對腫瘤生長和神經浸潤至關重要

為闡明 Grin2d 在癌細胞中的生物學意義，作者采用短發(fā)夾 RNA（shRNA）敲低（shGrin2d）和 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)敲除（Grin2d?/?）兩種方法，在具有高再增殖率的商業(yè)可用 KPC-Pdx1CRE 細胞系中進行基因編輯。該細胞系在 Pdx1 啟動子控制下表達 Cre 重組酶，并攜帶條件性表達的 Trp53 R175H 突變等位基因，與 Li-Fraumeni 人同源物 TP53 R175H 類似。作者發(fā)現(xiàn) KPC-Pdx1CRE 細胞中 Grin2d 的表達水平與 TPAC 相當，且均高于原代 KPC 細胞，免疫熒光染色顯示 KPC-Pdx1CRE 移植小鼠腫瘤中基礎 GRIN2D 水平高于 KPC 小鼠腫瘤（圖 S5A、S5B）。RT-qPCR 和 Western blot 驗證顯示，生成的 shGrin2d 細胞中 Grin2d 在 mRNA 和蛋白水平均顯著降低（圖 4A）；在 Grin2d 敲除細胞中，用內含子 gRNA 靶向 Grin2d 基因的關鍵外顯子 3，導致蛋白完全缺失（圖 4B）。

功能表征顯示，通過侵襲、遷移和傷口愈合實驗檢測，shGrin2d 和 Grin2d?/?細胞對 L - 谷氨酸和 DRG CM 處理無反應（圖 S5C-S5G）。MTT 實驗評估顯示細胞代謝活性無差異，集落形成特性也無差異（圖 S5H-S5K）。

為驗證體內 Grin2d 缺失的影響，作者將 KPC-Pdx1CRE Grin2d?/?和 shGrin2d 細胞，以及相應的對照細胞（Grin2d?/?和 shNT，Grin2d 基因未修飾）原位植入 6 周齡雌性 C57BL/6N 小鼠胰腺（圖 4C）。結果顯示，植入 shGrin2d 和 Grin2d?/?細胞組的小鼠總生存期顯著高于相應對照組（圖 4D）。

生存期延長對應著 shGrin2d 和 Grin2d?/?組與對照組相比，腫瘤生長速率降低（監(jiān)測至植入后 55 天）。此外，實驗終點時腫瘤體積顯著減小，導致胰腺重量降低，腹膜轉移數(shù)量也減少（圖 4E、S6A-S6F）。而且，shGrin2d 和 Grin2d?/?組小鼠胰腺中谷氨酸水平降低，但支配胰腺的 T8-T12 DRG 中谷氨酸水平升高，血清谷氨酸水平無變化（圖 4F、4G、S6G、S6H）。Grin2d?/?和 shGrin2d 腫瘤中切割的 caspase9 水平升高，這也可以解釋腫瘤體積的減?。▓D 4H、S6I）。此外，與相應對照組相比，shGrin2d 和 Grin2d?/?組腫瘤及其周圍組織的神經浸潤減少，表現(xiàn)為外周神經元的主要標志物 PGP9.5 水平降低（圖 4I、S6J）。同時，shGrin2d 和 Grin2d?/?組中 GRIN2D 的蛋白表達降低，且 Grin2d 基因表達的上游調節(jié)因子轉錄因子 EZH2 和 CaMK4 也下調（圖 4I、S6J）。

綜上，本部分結果表明癌細胞中 Grin2d 的表達在體內腫瘤進展和神經浸潤中起著關鍵作用，可能觸發(fā)感覺背根神經節(jié)神經元中谷氨酸的過度產生，從而啟動癌細胞與感覺神經元之間的正反饋循環(huán)，在體內驅動腫瘤生長。

（五）GRIN2D 敲除對癌細胞腫瘤周圍神經發(fā)生的影響

為揭示 Grin2d 介導的腫瘤神經浸潤的潛在分子機制，作者對原位植入的 Grin2d?/?和 Grin2d?/?腫瘤進行了 mRNA 測序。在候選基因中，7 個神經營養(yǎng)因子或受體（Fgf1、Fgfr4、Egfr、Gmfg、Tgfb1i1、Efnb1、Tgfa）被視為潛在的神經浸潤介質（圖 5A、S7A）。通過 RT-qPCR 進一步驗證，發(fā)現(xiàn) Egfr 及其配體轉化生長因子 α（TGFA）在 Grin2d?/?植入腫瘤中顯著下調，成為研究重點（圖 5B）。在 Grin2d 編輯的 KPC-Pdx1CRE 細胞中，EGFR 蛋白水平也呈現(xiàn)類似趨勢（圖 S7B）。

作者在體外探索了 TGFA 對 DRG 神經元的影響，發(fā)現(xiàn)重組 TGFA 處理后小鼠 DRG 神經元中 EGFR 激活（圖 5C），且軸突生成增加（圖 5D、S7C）。免疫組織化學染色證實，在 Grin2d?/?和 shGrin2d 原位植入腫瘤中，EGFR 及其配體 TGFA 水平降低（圖 5E、S7D）。

作者隨后探究是否是感覺神經及其釋放的 L - 谷氨酸驅動癌細胞中 Grin2d 的表達，在體外采用辣椒素消融 TRPV1? DRG 神經元。結果顯示，DRG 神經元數(shù)量增加與 KPC-Pdx1CRE 細胞 - 神經元共培養(yǎng)物中 TRPV1 表達升高相關（圖 S7E）。將 KPC-Pdx1CRE 細胞與經辣椒素預處理的 DRG 共培養(yǎng)，免疫細胞化學染色顯示 TRPV1 表達降低（圖 5F、S7F、S7G）。通過 ELISA 測量共培養(yǎng)物（KPC-Pdx1CRE 細胞與不同數(shù)量 DRG）裂解物和 / 或上清液中的 TRPV1、P 物質（SP）和 CGRP，結果顯示即使在 KPC-Pdx1CRE 細胞中 Grin2d 被敲除，其表達也降低，與辣椒素處理效果相似（圖 5G-5I、S7H）。此外，經辣椒素處理的 KPC-Pdx1CRE-DRG 共培養(yǎng)物中 GRIN2D 含量降低，而 L - 谷氨酸處理可逆轉這種降低（圖 5J）。

（六）感覺神經元消融后癌細胞中 GRIN2D 敲除的影響

為在體內驗證上述觀察結果，作者將 KPC-Pdx1CRE-Grin2d?/?和相應的對照細胞（KPC-Pdx1CRE-Grin2d?/?）植入 42 日齡 C57BL/6N 小鼠（雌雄均有）胰腺，這些小鼠在出生后第 2 天（P2）通過腹腔注射辣椒素進行感覺神經消融（圖 6A）。結果顯示，實驗終點時 Grin2d?/?組腫瘤體積顯著減小，胰腺重量降低。重要的是，僅當 Grin2d 完整（Grin2d?/?）時，外源性（腹腔注射）谷氨酸供應可逆轉辣椒素處理小鼠的腫瘤縮小，而溶劑處理對照組腫瘤大小無增加（圖 6B、6C、S8A、S8B）。此外，P2 小鼠經辣椒素處理后，成年時 T8-T12 DRG 中的神經元密度降低（圖 6D）。感覺纖維消融還通過 T8-T12 DRG 中 TRPV1 和 NF200 密度降低得到進一步證實（圖 6E），且辣椒素處理后腫瘤組織中 TRPV1?或 NF200?神經纖維也相應減少（圖 6F）。

作者還利用 Trpv1 敲除小鼠研究感覺神經元消融對 PDAC 進展的影響。與 Grin2d?/? KPC-Pdx1CRE 植入模型中觀察到的 TGFA 促神經發(fā)生效應一致，與 Trpv1 野生型（WT）神經元相比，Trpv1 敲除（KO）DRG 神經元上清液和細胞裂解物中 TGFA 分泌減少，且 L - 谷氨酸水平也降低（圖 S9A、S9B）。盡管 KPC-Pdx1CRE 和 TPAC 細胞與 Trpv1 敲除 DRG 共培養(yǎng)可增強 TGFA 釋放，但分泌水平仍低于與 Trpv1 野生型 DRG 共培養(yǎng)的水平。值得注意的是，與 TPAC 細胞相比，KPC-Pdx1CRE 細胞與 Trpv1 野生型 DRG 共培養(yǎng)時，細胞外 TGFA 分泌增加更多，盡管 TPAC 細胞基線 TGFA 分泌更高，且 KPC-Pdx1CRE 細胞內 TGFA 水平增加更顯著（圖 S9B）。

為增強癌細胞的神經親和力，作者在 Grin2d?/?和 Grin2d?/? KPC-Pdx1CRE 細胞中，在 EF1a 啟動子下穩(wěn)定過表達小鼠 Tgfa 基因。Western blot 證實，生成的 Grin2d?/?；Tgfa-Tg 和 Grin2d?/?；Tgfa-Tg KPC-Pdx1CRE 細胞系中 TGFA 蛋白水平顯著增加（圖 6G）。在 3D 遷移實驗中，KPC-Pdx1CRE 細胞表現(xiàn)出與 TPAC 細胞相似的神經親和生長能力，且對野生型 DRG 的侵襲性高于 KPC 細胞系，Tgfa 表達上調進一步增強了這種能力，但對 Trpv1 敲除 DRG 的侵襲性顯著降低（圖 S9C）。

作者將過表達或不過表達 Tgfa 的癌細胞原位植入 Trpv1 敲除和 C57BL/6N 野生型小鼠（6-8 周齡，雌雄均有）胰腺，形成四個實驗組：Grin2d?/?、Grin2d?/?、Grin2d?/?；Tgfa-Tg、Grin2d?/?；Tgfa-Tg（圖 6H）。研究終點時，盡管 Trpv1 敲除小鼠中 Grin2d?/?；Tgfa-Tg 組腫瘤顯著大于 Grin2d?/?組，但其腫瘤體積仍明顯小于 Trpv1 野生型 Grin2d?/?；Tgfa-Tg 組，后者腫瘤生長最顯著（圖 6I）。

作者通過 von Frey 細絲測試量化了感覺神經元消融后實驗小鼠的疼痛感覺。Trpv1 野生型小鼠對 von Frey 細絲機械刺激的基線敏感性顯著高于 Trpv1 敲除小鼠。在 Trpv1 野生型小鼠中，與 Grin2d?/?；Tgfa-Tg 組相比，移植 Grin2d?/?；Tgfa-Tg 細胞的小鼠腫瘤更大，且機械疼痛敏感性更高。疼痛感覺的增加比植入相同基因編輯細胞的 Trpv1 敲除小鼠更顯著，也超過了 Trpv1 野生型小鼠植入前的基線敏感性。值得注意的是，Trpv1 敲除小鼠在腫瘤植入后未表現(xiàn)出類似的疼痛敏感性增加，表明腫瘤相關機械疼痛存在 Trpv1 依賴機制（圖 6J）。

為進一步闡明通過 TGFA-EGFR 信號的前饋環(huán)路，作者在 Tgfa 啟動子內鑒定出兩個預測的 EZH2 結合位點（圖 S9D、S9E）。ChIP-PCR 分析顯示，在 KPC-Pdx1CRE 細胞中沉默 Ezh2 顯著降低其在 Tgfa 啟動子處的富集，且在 Grin2d?/? KPC-Pdx1CRE 細胞中，EZH2 在相同位點的富集也進一步降低（圖 S9F、S9G）。在 KPC-Pdx1CRE 細胞中，Grin2d 及其上游調節(jié)因子 Ezh2 的缺失抑制了 EZH2-GRIN2D-TGFA 信號通路的信號轉導分子（EGFR、E2F1、pCREB1 Ser133、TGFA）的表達水平（圖 S9H）。值得注意的是，外源性 L - 谷氨酸應用無法完全恢復由 Grin2d 或 Ezh2 缺失引起的 E2F1 和 pCREB1 Ser133 的降低，而 TGFA 水平則部分恢復。相反，在 siNT 或 Grin2d?/? KPC-Pdx1CRE 細胞中，這些信號蛋白在谷氨酸刺激下顯著上調（圖 S9I、S9J）。

作者的 RNA-seq 分析顯示，小鼠胰腺癌細胞中 Grin2d 敲除導致 Cacna1h（Cav3.2，T 型鈣通道）基因下調和 Cacna1c（Cav1.2，L 型鈣通道）基因上調（圖 S9K）。相應地，鈣成像顯示 Grin2d?/?細胞中鈣內流完全消失，而 Grin2d?/?細胞中鈣內流強烈（圖 S9L），這表明 Cacna1h 表達降低會功能性損害鈣進入。鑒于 Cacna1h 在低閾值瞬時鈣內流中的作用，盡管 Cacna1c 上調，但其缺失仍可能導致觀察到的信號缺陷。癌細胞常表現(xiàn)出由 L 型和 T 型電壓依賴性鈣通道（VdCCs）介導的自發(fā)性鈣內流和膜去極化，這在與神經元共培養(yǎng)的突觸后 PDAC 細胞中已觀察到。NMDA 受體激活依賴于谷氨酸結合，谷氨酸可能來源于特定微結構域（即 “偽突觸”，類似于三方突觸）的局部釋放。NMDA 受體激活可產生額外的獨立鈣電流。VdCCs 引起的自發(fā)性鈣內流活動導致去極化，使 NMDA 受體更容易釋放 Mg2?阻斷。腫瘤環(huán)境中這種空間受限的谷氨酸能信號使 NMDA 受體局部激活和下游鈣信號傳導成為可能。這些發(fā)現(xiàn)支持一個模型：通過 VdCCs 的自發(fā)性去極化通過解除 Mg2?阻斷降低 NMDA 受體的激活閾值，其中含 GRIN2D 的 NMDA 受體介導谷氨酸依賴性鈣內流，補充胰腺癌細胞中基線電壓依賴性鈣信號。這些發(fā)現(xiàn)表明 Grin2d 通過 Cacna1h 調節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)，可能影響 KPC-Pdx1CRE 細胞的行為。對 TCGA 數(shù)據集的進一步分析顯示，CACNA1H 高表達與 PDAC 患者總生存期改善顯著相關（圖 S9M）。

綜上，本部分結果表明感覺神經元消融后，Grin2d 敲除可影響 PDAC 腫瘤生長、神經浸潤及相關疼痛感覺，且 Grin2d 通過調控鈣通道和相關信號通路參與 PDAC 進展。

（七）感覺神經元通過神經元 - 癌癥偽突觸向人 PDAC 中的胰腺癌細胞提供谷氨酸

為探究神經元釋放的谷氨酸是否能通過偽突觸信號激活胰腺癌細胞中的 NMDAR，作者利用透射電子顯微鏡（TEM）檢查了患者來源的 PDAC 標本中突觸結構的存在。TEM 掃描顯示了神經浸潤的兩種類型，即神經內浸潤和神經周浸潤（圖 7A、S10A）。值得注意的是，在癌細胞周圍觀察到分散且分布明顯的神經軸突（Ax），為神經元 - 癌癥偽突觸結構奠定了基礎（圖 7Aa1、7Aa2）。此外，作者發(fā)現(xiàn)高密度的突觸前終扣與侵犯的癌細胞接觸，其中既有大的致密核心小泡（可能含有神經肽），也有小的突觸小泡（表明存在谷氨酸等分子神經遞質）（圖 7Ab）。

關鍵發(fā)現(xiàn)是，在人 PDAC 樣本中，突觸后膜上清晰可見高度組織化的深色電子致密區(qū)域，即突觸后致密區(qū)（PSD）（圖 7B1-7B3）。這與中樞神經系統(tǒng)（CNS）中已知的興奮性突觸超微結構一致，表明癌細胞膜上突觸后受體的集中，且連接到突觸后 GRIN2D 的神經元突觸前具有釋放和接收機制的組件。

健康神經中的軸 - 軸突觸很少見，僅在神經橫切面上偶爾可見；然而，作者在神經浸潤部位發(fā)現(xiàn)了大量的神經元 - 癌癥偽突觸，即使在較小的神經單橫切面上也是如此（圖 7B）。TEM 圖像進一步顯示了在這些神經元 - 癌癥偽突觸中 GRIN1 和 SLC17A6 的免疫金染色（圖 7C）。

為量化潛在的偽突觸位點，作者測量了 19 個患者來源的 PDAC 標本中 GRIN2D、PANCK 和 SLC17A6 的共定位位點，結果平均為 43.02±6.96 個偽突觸 /mm2（圖 S10B-S10D）。此外，作者觀察到，與植入 Grin2d?/?-KPC-Pdx1CRE 細胞的小鼠相比，植入 Grin2d?/?-KPC-Pdx1CRE 細胞的小鼠中，通過 DLG4、CK19 和 SLC17A6 共定位量化的潛在腫瘤偽突觸位點數(shù)量增加（19.00±2.36 vs. 9.71±1.77 個偽突觸 /mm2）（圖 S10E、S10F）。而且，Grin2d?/?-KPC-Pdx1CRE 腫瘤中突觸標志物 DLG4、VAMP1 和 SLC17A6 的表達顯著低于 Grin2d?/?-KPC-Pdx1CRE 腫瘤（圖 S10G、S10H）。

與對人 PDAC 標本的 TEM 分析一致，作者在體外進一步觀察到，從轉染了 Slc17a6-RFP 的神經元延伸出的軸突與轉染了 GRIN2D-GFP 的 SU.86.86 癌細胞之間形成了神經元 - 癌癥偽突觸。這些偽突觸在神經元 - 癌癥接觸位點周圍顯示出 SLC17A6 的分散分布（圖 S10I1、S10I2）。為在體外進一步支持該假設，掃描電子顯微鏡（SEM）顯示了終末軸突與癌細胞形成的偽突觸（圖 7Da）。在這里，神經軸突包裹并終止在癌細胞上，而癌細胞與突觸前和突觸后神經元之間的突觸間隙相鄰，形成神經元 - 癌癥偽突觸（圖 7Db），3D 重建視頻（Video S1）進一步展示了這一現(xiàn)象。值得注意的是，神經元 SLC17A6 紅色斑點與 SU.86.86 GRIN2D-GFP 表達緊密相關，顯示出神經元 - 癌癥偽突觸的位點（圖 7E）。

綜上，本部分結果為神經元和胰腺癌細胞建立偽突觸以促進神經元谷氨酸傳遞給癌細胞提供了有力證據。

本研究圍繞感官神經元與胰腺導管腺癌（PDAC）細胞的相互作用展開，首次證實了在腦外癌癥（PDAC）中感官神經末梢與癌細胞之間存在偽突觸連接。研究發(fā)現(xiàn)，這些偽突觸中 NMDA 受體亞基 GRIN2D/GluN2D 選擇性富集，使 PDAC 細胞對神經元來源的谷氨酸產生應答，進而促進腫瘤生長和擴散。通過一系列體內外實驗，闡明了谷氨酸通過 GRIN2D 信號驅動 PDAC 進展的分子機制，包括 CAMK IV-CREB 通路和 E2F1 介導的 EZH2 激活調控 GRIN2D 表達，以及 GRIN2D 觸發(fā) EGFR-TGFA 信號促進腫瘤周圍神經浸潤等。同時，破壞偽突觸處谷氨酸 - GRIN2D 信號可顯著改善 PDAC 模型小鼠的生存狀況。此外，研究還發(fā)現(xiàn) GRIN2D 在多種人類癌癥中表達升高，暗示其可能具有更廣泛的臨床意義。該研究不僅揭示了 PDAC 進展的新機制，還為開發(fā)以癌癥 - 神經元偽突觸為靶點的癌癥神經科學指導的腫瘤治療策略提供了重要理論依據和實驗基礎。