01一、文章信息

發(fā)表雜志名稱：Cancer Cell

中文標(biāo)題：感官神經(jīng)元通過谷氨酸能神經(jīng)元 - 癌癥偽突觸驅(qū)動(dòng)胰腺癌進(jìn)展

英文標(biāo)題：Sensory neurons drive pancreatic cancer progression through glutamatergic neuron-cancer pseudo-synapses

影響因子：44.5

發(fā)表日期：2025 年 9 月 25 日

01二、研究概述

Ren 等人的研究證實(shí)了感官神經(jīng)元與胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）細(xì)胞之間存在偽突觸連接。這些偽突觸中，NMDA 受體亞基 GRIN2D/GluN2D 富集，增強(qiáng)了 PDAC 細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元來源谷氨酸的反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。在 PDAC 模型中，破壞偽突觸處的谷氨酸 - GRIN2D 信號(hào)可改善小鼠生存狀況，這一發(fā)現(xiàn)凸顯了靶向癌癥 - 神經(jīng)元偽突觸的治療潛力。此外，研究還揭示了感官神經(jīng)支配通過 TGFA-EGFR 信號(hào)的前饋環(huán)路調(diào)控 PDAC 細(xì)胞中 Grin2d 的上調(diào)，以及 Grin2d 在腫瘤生長(zhǎng)、神經(jīng)浸潤(rùn)等過程中的關(guān)鍵作用，為癌癥神經(jīng)科學(xué)指導(dǎo)的腫瘤治療提供了新方向。

01三、研究結(jié)果
（一）GRIN2D 在 PDAC 中的表達(dá)及其功能意義

作者首先分析了患者來源的 PDAC 腫瘤活檢樣本和相應(yīng)人腹腔神經(jīng)節(jié)標(biāo)本中谷氨酸受體亞型的表達(dá)，并擴(kuò)展到 TCGA 數(shù)據(jù)庫中的人 PDAC 組織，發(fā)現(xiàn) GRIN2D 基因（NMDAR 家族成員）表達(dá)顯著升高（圖 1A、1B）。與正常胰腺相比，PDAC 中 GRIN1、GRIN2A 和 GRIN2D 表達(dá)均升高，且僅 GRIN2D 與 TNM 分期中的 T 期和 N 期顯著相關(guān)（圖 S1A、S1B、S1C）。在多種人類癌癥中，GRIN2D 表達(dá)也高于正常組織（圖 S1D），且在人 PDAC 樣本中，GRIN1 和 GRIN2D 在 NMDAR 組件中存在顯著共表達(dá)和相關(guān)性（圖 S1E）。在人神經(jīng)親和性 SU.86.86、T3M4 細(xì)胞系和非神經(jīng)親和性 Panc-1、Capan-1 細(xì)胞系，以及小鼠神經(jīng)親和性 TPAC 細(xì)胞系和非神經(jīng)親和性 KPC 細(xì)胞系中，GRIN2D 在 NMDAR 亞型中表達(dá)最高，且與 GRIN1 共表達(dá)（圖 S1F-S1K）。

通過對(duì)兩個(gè)單細(xì)胞 RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)集（70 個(gè)人 PDAC 腫瘤的 325,480 個(gè)細(xì)胞）分析，作者發(fā)現(xiàn) GRIN2D 選擇性富集在惡性上皮細(xì)胞中，在非惡性群體中表達(dá)極少（圖 1C、1D、S2A-S2D），且未接受治療的腫瘤中 GRIN2D 表達(dá)高于接受 FOLFIRINOX 治療且應(yīng)答不佳的腫瘤（圖 S2E）。

為評(píng)估 L - 谷氨酸（GRIN2D 亞基的配體）的影響，作者測(cè)試了不同濃度 L - 谷氨酸對(duì)細(xì)胞的作用，發(fā)現(xiàn) 0.5μM L - 谷氨酸能最佳刺激癌細(xì)胞中 GRIN2D 轉(zhuǎn)錄，且不影響細(xì)胞生長(zhǎng)（圖 S2F-S2L）。神經(jīng)親和性細(xì)胞系 SU.86.86、T3M4、TPAC 在 L - 谷氨酸和 DRG 條件培養(yǎng)基（CM）處理下，遷移和侵襲能力增強(qiáng)，而非神經(jīng)親和性細(xì)胞 Panc-1、Capan-1、KPC 則無此變化（圖 1E-1G）。用 GRIN2D 選擇性拮抗劑 UBP145 預(yù)處理，可逆轉(zhuǎn) SU.86.86、T3M4、TPAC 細(xì)胞的遷移和侵襲行為，但對(duì)非神經(jīng)親和性細(xì)胞系無影響（圖 1H、1I、S2M）。在 SU.86.86 和 Capan-1 細(xì)胞中沉默 GRIN2D（siGRIN2D），也產(chǎn)生了與 UBP145 類似的抑制效果，尤其在神經(jīng)親和性 SU.86.86 細(xì)胞中（圖 1J-1L）。

綜上，本部分結(jié)果表明 L - 谷氨酸通過 NMDAR 亞型 GRIN2D 增強(qiáng)了神經(jīng)親和性 PDAC 細(xì)胞的遷移表型。

（二）PDAC 中 GRIN2D/NMDAR 通路組件的檢測(cè)

作者通過 RT-qPCR 檢測(cè)了人 SU.86.86、Capan-1 細(xì)胞和小鼠 TPAC、KPC 細(xì)胞中 9 個(gè)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的水平，發(fā)現(xiàn)除人細(xì)胞中 SLC1A3 和小鼠細(xì)胞中 Slc7a11 表達(dá)較高外，其他轉(zhuǎn)運(yùn)體基因表達(dá)水平相當(dāng)且較低，且 Western blot 分析顯示 SLC1A3、SLC7A11 和 SLC17A6（突觸小泡谷氨酸裝載關(guān)鍵蛋白）在這些細(xì)胞系中含量極低（圖 S3A-S3C）。

作者發(fā)現(xiàn)人 PDAC 組織中 GRIN2D 和 GRIN1 共表達(dá)且水平高于正常胰腺組織（圖 S3D、S3E），進(jìn)一步研究顯示，在侵犯神經(jīng)的癌細(xì)胞中，GRIN2D、GRIN1 和 DLG4 蛋白顯著富集，而在未參與神經(jīng)侵犯的癌細(xì)胞中則無此現(xiàn)象（圖 2A）。同時(shí)，被癌細(xì)胞侵犯的神經(jīng)中，VAMP1（突觸小泡相關(guān)膜蛋白 1）和 SLC17A6（囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體 2）水平顯著高于未被侵犯的神經(jīng)（圖 2B）。

DRG 條件培養(yǎng)基（CM）處理后，神經(jīng)親和性 SU.86.86、T3M4、TPAC 細(xì)胞中 GRIN1（Grin1）和 GRIN2D（Grin2d）表達(dá)上調(diào)，而非神經(jīng)親和性細(xì)胞中 GRIN1 和 GRIN2D mRNA 表達(dá)顯著降低（圖 S3）。Western blot 分析顯示，DRG CM 處理顯著增加人神經(jīng)親和性癌細(xì)胞系（尤其是 SU.86.86 細(xì)胞）中 GRIN2D、GRIN1 和 DLG4 的蛋白表達(dá)，而非神經(jīng)親和性 Panc-1 和 Capan-1 細(xì)胞中這些蛋白水平未改變或降低（圖 S3F-S3H）。免疫細(xì)胞化學(xué)分析顯示，在 SU.86.86-DRG 共培養(yǎng)物中，癌細(xì)胞中 GRIN2D、GRIN1、DLG4 和神經(jīng)元中 VAMP1、SLC17A6 表達(dá)顯著，而在 Capan1-DRG 共培養(yǎng)物中表達(dá)不明顯（圖 2C、2D）。與 DRG 共培養(yǎng)可提高神經(jīng)親和性 SU.86.86 和 T3M4 細(xì)胞中 GRIN1、GRIN2D 和 DLG4 的蛋白表達(dá)，但對(duì)非神經(jīng)親和性 Panc-1 和 Capan-1 細(xì)胞無此作用（圖 S3I、S3J）。在 SU.86.86 細(xì)胞中敲除 GRIN2D 基因，可逆轉(zhuǎn)上述效應(yīng)并影響 GRIN1 和 DLG4 的誘導(dǎo)表達(dá)，而在 Capan-1 細(xì)胞中未觀察到這種情況（圖 S3K）。

綜上，本部分結(jié)果表明癌細(xì)胞中特定 NMDAR 亞基（尤其是 GRIN2D）的表達(dá)伴隨著神經(jīng)元中突觸前谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)。

（三）L - 谷氨酸通過 CAMK IV-CREB 通路和 E2F1 介導(dǎo)的 EZH2 激活觸發(fā) GRIN2D 表達(dá)

利用 ARCHS4 數(shù)據(jù)庫，作者發(fā)現(xiàn) Zeste 2 多梳抑制復(fù)合物 2 亞基增強(qiáng)子（EZH2）是調(diào)控人細(xì)胞中 GRIN2D 表達(dá)的最潛在重要轉(zhuǎn)錄因子（TF）。在 TCGA 數(shù)據(jù)集中，人 PDAC 細(xì)胞中僅 GRIN1 和 GRIN2D 與 EZH2 表達(dá)共表達(dá)且呈正相關(guān)（圖 S4A、S4B）。染色質(zhì)免疫沉淀 PCR（ChIP-PCR）實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) GRIN2D 基因區(qū)域內(nèi)有兩個(gè)潛在的 EZH2 結(jié)合位點(diǎn)（圖 S4C），且 SU.86.86 細(xì)胞經(jīng) L - 谷氨酸處理后，EZH2 與 GRIN2D 的結(jié)合富集增加（圖 3A）。L - 谷氨酸處理后，僅神經(jīng)親和性人 PDAC 細(xì)胞中 GRIN2D 和 EZH2 水平同步升高，非神經(jīng)親和性 PDAC 細(xì)胞中無此效應(yīng)（圖 S4D）。免疫細(xì)胞化學(xué)分析顯示，L - 谷氨酸和 DRG CM 均能上調(diào) SU.86.86 細(xì)胞中 EZH2 水平，但對(duì) Capan-1 細(xì)胞無此作用（圖 3B）。在 EZH2 siRNA 沉默組中，經(jīng) L - 谷氨酸和 DRG CM 處理后，GRIN2D 水平顯著降低（圖 3C、3D）。

已知 E2F 轉(zhuǎn)錄因子 1（E2F1）是 EZH2 表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，作者發(fā)現(xiàn) SU.86.86 細(xì)胞中沉默 E2F1 后，E2F1 在 EZH2 啟動(dòng)子處的富集顯著減少（圖 3E），且鑒定出 EZH2 啟動(dòng)子上三個(gè)相應(yīng)的 E2F1 結(jié)合位點(diǎn)（圖 S4E）。siRNA 介導(dǎo)的 E2F1 沉默后，SU.86.86 細(xì)胞中 EZH2 表達(dá)顯著下調(diào)（圖 3F）。

作者進(jìn)一步研究 EZH2-E2F1 信號(hào)通路對(duì) GRIN2D 的調(diào)控作用，發(fā)現(xiàn) SU.86.86 細(xì)胞經(jīng) L - 谷氨酸或 DRG CM 處理后，EZH2-E2F1 軸信號(hào)分子（EZH2、H3K27me3、pRB Ser780、E2F1、CyclinD1、CDK4）蛋白水平升高，而 CDKN2A 表達(dá)降低，Capan-1 細(xì)胞中這些蛋白表達(dá)無差異（圖 3G、S4F-S4H）。L - 谷氨酸處理使 SU.86.86 細(xì)胞中 EZH2 和 H3K27me3 水平升高、CDKN2A 表達(dá)降低，而轉(zhuǎn)染 EZH2 siRNA 可逆轉(zhuǎn) CDK2NA 和 H3K27me3 的表達(dá)變化（圖 S4I）。此外，siRNA 下調(diào) EZH2 可導(dǎo)致經(jīng) L - 谷氨酸和 DRG CM 處理的 SU.86.86 細(xì)胞中 E2F1 和 pRB Ser780 減少（圖 S4J）。

已知谷氨酸（尤其是配體刺激的 NMDAR 激活）會(huì)觸發(fā)神經(jīng)元鈣內(nèi)流，進(jìn)而啟動(dòng)下游鈣 / 鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶 4（CAMK4）通路，且 EZH2 表達(dá)受 Ser133 磷酸化的環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白 1（CREB1）正調(diào)控。作者發(fā)現(xiàn) SU.86.86 細(xì)胞經(jīng) L - 谷氨酸處理后，CAMK4 和 pCREB1 Ser133 同步激活（圖 S4K），而 CAMK4 沉默后，這些變化被消除，且谷氨酸依賴性 EZH2 水平降低（圖 3H、S4L）。

通過神經(jīng)元 - 癌細(xì)胞共培養(yǎng)中的鈣成像記錄，作者證實(shí)人 SU.86.86 細(xì)胞中存在功能性含 GRIN2D 的 NMDA 受體，谷氨酸誘導(dǎo)的反應(yīng)呈劑量依賴性，且可被特定 NMDA 受體拮抗劑（如 UBP141 和 AP5）調(diào)節(jié)，胰腺癌細(xì)胞靜息膜電位為 - 50.07±3.33mV（圖 3I-3L、S4M）。單獨(dú)培養(yǎng)的 SU.86.86 細(xì)胞無此反應(yīng)，表明神經(jīng)元與癌細(xì)胞的物理接近 / 接觸對(duì)胰腺癌細(xì)胞中 GRIN2D 信號(hào)的正常運(yùn)作至關(guān)重要（圖 3M）。此外，SU.86.86 細(xì)胞與神經(jīng)元共培養(yǎng)時(shí)，在無外部刺激情況下出現(xiàn)自發(fā)性鈣內(nèi)流，該活動(dòng)主要依賴 L 型和 T 型鈣通道而非 L - 谷氨酸，提示 GRIN2D 可能作為谷氨酸 “傳感器”，偽突觸處癌細(xì)胞的鈣內(nèi)流可能由感覺神經(jīng)元激活誘導(dǎo)（圖 S4N）。作者還證實(shí)，外源性應(yīng)用 NMDA 可特異性激活共培養(yǎng)小鼠 DRG 神經(jīng)元的 SU.86.86 細(xì)胞上的 Ca2?電流，單獨(dú)培養(yǎng)的 SU.86.86 細(xì)胞無此反應(yīng)（圖 S4O、S4P）。

綜上，本部分結(jié)果表明 L - 谷氨酸通過激活 CAMK4-CREB1 信號(hào)通路和 EZH2-E2F1-p-Rb 信號(hào)通路，調(diào)控 PDAC 中 GRIN2D 的表達(dá)，且含 GRIN2D 的谷氨酸能受體在癌細(xì)胞上具有功能性。

（四）小鼠胰腺癌細(xì)胞中的 Grin2d 對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和神經(jīng)浸潤(rùn)至關(guān)重要

為闡明 Grin2d 在癌細(xì)胞中的生物學(xué)意義，作者采用短發(fā)夾 RNA（shRNA）敲低（shGrin2d）和 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)敲除（Grin2d?/?）兩種方法，在具有高再增殖率的商業(yè)可用 KPC-Pdx1CRE 細(xì)胞系中進(jìn)行基因編輯。該細(xì)胞系在 Pdx1 啟動(dòng)子控制下表達(dá) Cre 重組酶，并攜帶條件性表達(dá)的 Trp53 R175H 突變等位基因，與 Li-Fraumeni 人同源物 TP53 R175H 類似。作者發(fā)現(xiàn) KPC-Pdx1CRE 細(xì)胞中 Grin2d 的表達(dá)水平與 TPAC 相當(dāng)，且均高于原代 KPC 細(xì)胞，免疫熒光染色顯示 KPC-Pdx1CRE 移植小鼠腫瘤中基礎(chǔ) GRIN2D 水平高于 KPC 小鼠腫瘤（圖 S5A、S5B）。RT-qPCR 和 Western blot 驗(yàn)證顯示，生成的 shGrin2d 細(xì)胞中 Grin2d 在 mRNA 和蛋白水平均顯著降低（圖 4A）；在 Grin2d 敲除細(xì)胞中，用內(nèi)含子 gRNA 靶向 Grin2d 基因的關(guān)鍵外顯子 3，導(dǎo)致蛋白完全缺失（圖 4B）。

功能表征顯示，通過侵襲、遷移和傷口愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，shGrin2d 和 Grin2d?/?細(xì)胞對(duì) L - 谷氨酸和 DRG CM 處理無反應(yīng)（圖 S5C-S5G）。MTT 實(shí)驗(yàn)評(píng)估顯示細(xì)胞代謝活性無差異，集落形成特性也無差異（圖 S5H-S5K）。

為驗(yàn)證體內(nèi) Grin2d 缺失的影響，作者將 KPC-Pdx1CRE Grin2d?/?和 shGrin2d 細(xì)胞，以及相應(yīng)的對(duì)照細(xì)胞（Grin2d?/?和 shNT，Grin2d 基因未修飾）原位植入 6 周齡雌性 C57BL/6N 小鼠胰腺（圖 4C）。結(jié)果顯示，植入 shGrin2d 和 Grin2d?/?細(xì)胞組的小鼠總生存期顯著高于相應(yīng)對(duì)照組（圖 4D）。

生存期延長(zhǎng)對(duì)應(yīng)著 shGrin2d 和 Grin2d?/?組與對(duì)照組相比，腫瘤生長(zhǎng)速率降低（監(jiān)測(cè)至植入后 55 天）。此外，實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)腫瘤體積顯著減小，導(dǎo)致胰腺重量降低，腹膜轉(zhuǎn)移數(shù)量也減少（圖 4E、S6A-S6F）。而且，shGrin2d 和 Grin2d?/?組小鼠胰腺中谷氨酸水平降低，但支配胰腺的 T8-T12 DRG 中谷氨酸水平升高，血清谷氨酸水平無變化（圖 4F、4G、S6G、S6H）。Grin2d?/?和 shGrin2d 腫瘤中切割的 caspase9 水平升高，這也可以解釋腫瘤體積的減?。▓D 4H、S6I）。此外，與相應(yīng)對(duì)照組相比，shGrin2d 和 Grin2d?/?組腫瘤及其周圍組織的神經(jīng)浸潤(rùn)減少，表現(xiàn)為外周神經(jīng)元的主要標(biāo)志物 PGP9.5 水平降低（圖 4I、S6J）。同時(shí)，shGrin2d 和 Grin2d?/?組中 GRIN2D 的蛋白表達(dá)降低，且 Grin2d 基因表達(dá)的上游調(diào)節(jié)因子轉(zhuǎn)錄因子 EZH2 和 CaMK4 也下調(diào)（圖 4I、S6J）。

綜上，本部分結(jié)果表明癌細(xì)胞中 Grin2d 的表達(dá)在體內(nèi)腫瘤進(jìn)展和神經(jīng)浸潤(rùn)中起著關(guān)鍵作用，可能觸發(fā)感覺背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中谷氨酸的過度產(chǎn)生，從而啟動(dòng)癌細(xì)胞與感覺神經(jīng)元之間的正反饋循環(huán)，在體內(nèi)驅(qū)動(dòng)腫瘤生長(zhǎng)。

（五）GRIN2D 敲除對(duì)癌細(xì)胞腫瘤周圍神經(jīng)發(fā)生的影響

為揭示 Grin2d 介導(dǎo)的腫瘤神經(jīng)浸潤(rùn)的潛在分子機(jī)制，作者對(duì)原位植入的 Grin2d?/?和 Grin2d?/?腫瘤進(jìn)行了 mRNA 測(cè)序。在候選基因中，7 個(gè)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子或受體（Fgf1、Fgfr4、Egfr、Gmfg、Tgfb1i1、Efnb1、Tgfa）被視為潛在的神經(jīng)浸潤(rùn)介質(zhì)（圖 5A、S7A）。通過 RT-qPCR 進(jìn)一步驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn) Egfr 及其配體轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 α（TGFA）在 Grin2d?/?植入腫瘤中顯著下調(diào)，成為研究重點(diǎn)（圖 5B）。在 Grin2d 編輯的 KPC-Pdx1CRE 細(xì)胞中，EGFR 蛋白水平也呈現(xiàn)類似趨勢(shì)（圖 S7B）。

作者在體外探索了 TGFA 對(duì) DRG 神經(jīng)元的影響，發(fā)現(xiàn)重組 TGFA 處理后小鼠 DRG 神經(jīng)元中 EGFR 激活（圖 5C），且軸突生成增加（圖 5D、S7C）。免疫組織化學(xué)染色證實(shí)，在 Grin2d?/?和 shGrin2d 原位植入腫瘤中，EGFR 及其配體 TGFA 水平降低（圖 5E、S7D）。

作者隨后探究是否是感覺神經(jīng)及其釋放的 L - 谷氨酸驅(qū)動(dòng)癌細(xì)胞中 Grin2d 的表達(dá)，在體外采用辣椒素消融 TRPV1? DRG 神經(jīng)元。結(jié)果顯示，DRG 神經(jīng)元數(shù)量增加與 KPC-Pdx1CRE 細(xì)胞 - 神經(jīng)元共培養(yǎng)物中 TRPV1 表達(dá)升高相關(guān)（圖 S7E）。將 KPC-Pdx1CRE 細(xì)胞與經(jīng)辣椒素預(yù)處理的 DRG 共培養(yǎng)，免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示 TRPV1 表達(dá)降低（圖 5F、S7F、S7G）。通過 ELISA 測(cè)量共培養(yǎng)物（KPC-Pdx1CRE 細(xì)胞與不同數(shù)量 DRG）裂解物和 / 或上清液中的 TRPV1、P 物質(zhì)（SP）和 CGRP，結(jié)果顯示即使在 KPC-Pdx1CRE 細(xì)胞中 Grin2d 被敲除，其表達(dá)也降低，與辣椒素處理效果相似（圖 5G-5I、S7H）。此外，經(jīng)辣椒素處理的 KPC-Pdx1CRE-DRG 共培養(yǎng)物中 GRIN2D 含量降低，而 L - 谷氨酸處理可逆轉(zhuǎn)這種降低（圖 5J）。

綜上，本部分結(jié)果表明 GRIN2D 觸發(fā)的 EGFR-TGFA 信號(hào)在促進(jìn) PDAC 腫瘤周圍神經(jīng)浸潤(rùn)中起作用，且感覺神經(jīng)元以谷氨酸依賴的方式調(diào)節(jié)癌細(xì)胞 GRIN2D 的表達(dá)。

（六）感覺神經(jīng)元消融后癌細(xì)胞中 GRIN2D 敲除的影響

為在體內(nèi)驗(yàn)證上述觀察結(jié)果，作者將 KPC-Pdx1CRE-Grin2d?/?和相應(yīng)的對(duì)照細(xì)胞（KPC-Pdx1CRE-Grin2d?/?）植入 42 日齡 C57BL/6N 小鼠（雌雄均有）胰腺，這些小鼠在出生后第 2 天（P2）通過腹腔注射辣椒素進(jìn)行感覺神經(jīng)消融（圖 6A）。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí) Grin2d?/?組腫瘤體積顯著減小，胰腺重量降低。重要的是，僅當(dāng) Grin2d 完整（Grin2d?/?）時(shí)，外源性（腹腔注射）谷氨酸供應(yīng)可逆轉(zhuǎn)辣椒素處理小鼠的腫瘤縮小，而溶劑處理對(duì)照組腫瘤大小無增加（圖 6B、6C、S8A、S8B）。此外，P2 小鼠經(jīng)辣椒素處理后，成年時(shí) T8-T12 DRG 中的神經(jīng)元密度降低（圖 6D）。感覺纖維消融還通過 T8-T12 DRG 中 TRPV1 和 NF200 密度降低得到進(jìn)一步證實(shí)（圖 6E），且辣椒素處理后腫瘤組織中 TRPV1?或 NF200?神經(jīng)纖維也相應(yīng)減少（圖 6F）。

作者還利用 Trpv1 敲除小鼠研究感覺神經(jīng)元消融對(duì) PDAC 進(jìn)展的影響。與 Grin2d?/? KPC-Pdx1CRE 植入模型中觀察到的 TGFA 促神經(jīng)發(fā)生效應(yīng)一致，與 Trpv1 野生型（WT）神經(jīng)元相比，Trpv1 敲除（KO）DRG 神經(jīng)元上清液和細(xì)胞裂解物中 TGFA 分泌減少，且 L - 谷氨酸水平也降低（圖 S9A、S9B）。盡管 KPC-Pdx1CRE 和 TPAC 細(xì)胞與 Trpv1 敲除 DRG 共培養(yǎng)可增強(qiáng) TGFA 釋放，但分泌水平仍低于與 Trpv1 野生型 DRG 共培養(yǎng)的水平。值得注意的是，與 TPAC 細(xì)胞相比，KPC-Pdx1CRE 細(xì)胞與 Trpv1 野生型 DRG 共培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞外 TGFA 分泌增加更多，盡管 TPAC 細(xì)胞基線 TGFA 分泌更高，且 KPC-Pdx1CRE 細(xì)胞內(nèi) TGFA 水平增加更顯著（圖 S9B）。

為增強(qiáng)癌細(xì)胞的神經(jīng)親和力，作者在 Grin2d?/?和 Grin2d?/? KPC-Pdx1CRE 細(xì)胞中，在 EF1a 啟動(dòng)子下穩(wěn)定過表達(dá)小鼠 Tgfa 基因。Western blot 證實(shí)，生成的 Grin2d?/?；Tgfa-Tg 和 Grin2d?/?；Tgfa-Tg KPC-Pdx1CRE 細(xì)胞系中 TGFA 蛋白水平顯著增加（圖 6G）。在 3D 遷移實(shí)驗(yàn)中，KPC-Pdx1CRE 細(xì)胞表現(xiàn)出與 TPAC 細(xì)胞相似的神經(jīng)親和生長(zhǎng)能力，且對(duì)野生型 DRG 的侵襲性高于 KPC 細(xì)胞系，Tgfa 表達(dá)上調(diào)進(jìn)一步增強(qiáng)了這種能力，但對(duì) Trpv1 敲除 DRG 的侵襲性顯著降低（圖 S9C）。

作者將過表達(dá)或不過表達(dá) Tgfa 的癌細(xì)胞原位植入 Trpv1 敲除和 C57BL/6N 野生型小鼠（6-8 周齡，雌雄均有）胰腺，形成四個(gè)實(shí)驗(yàn)組：Grin2d?/?、Grin2d?/?、Grin2d?/?；Tgfa-Tg、Grin2d?/?；Tgfa-Tg（圖 6H）。研究終點(diǎn)時(shí)，盡管 Trpv1 敲除小鼠中 Grin2d?/?；Tgfa-Tg 組腫瘤顯著大于 Grin2d?/?組，但其腫瘤體積仍明顯小于 Trpv1 野生型 Grin2d?/?；Tgfa-Tg 組，后者腫瘤生長(zhǎng)最顯著（圖 6I）。

作者通過 von Frey 細(xì)絲測(cè)試量化了感覺神經(jīng)元消融后實(shí)驗(yàn)小鼠的疼痛感覺。Trpv1 野生型小鼠對(duì) von Frey 細(xì)絲機(jī)械刺激的基線敏感性顯著高于 Trpv1 敲除小鼠。在 Trpv1 野生型小鼠中，與 Grin2d?/?；Tgfa-Tg 組相比，移植 Grin2d?/?；Tgfa-Tg 細(xì)胞的小鼠腫瘤更大，且機(jī)械疼痛敏感性更高。疼痛感覺的增加比植入相同基因編輯細(xì)胞的 Trpv1 敲除小鼠更顯著，也超過了 Trpv1 野生型小鼠植入前的基線敏感性。值得注意的是，Trpv1 敲除小鼠在腫瘤植入后未表現(xiàn)出類似的疼痛敏感性增加，表明腫瘤相關(guān)機(jī)械疼痛存在 Trpv1 依賴機(jī)制（圖 6J）。

為進(jìn)一步闡明通過 TGFA-EGFR 信號(hào)的前饋環(huán)路，作者在 Tgfa 啟動(dòng)子內(nèi)鑒定出兩個(gè)預(yù)測(cè)的 EZH2 結(jié)合位點(diǎn)（圖 S9D、S9E）。ChIP-PCR 分析顯示，在 KPC-Pdx1CRE 細(xì)胞中沉默 Ezh2 顯著降低其在 Tgfa 啟動(dòng)子處的富集，且在 Grin2d?/? KPC-Pdx1CRE 細(xì)胞中，EZH2 在相同位點(diǎn)的富集也進(jìn)一步降低（圖 S9F、S9G）。在 KPC-Pdx1CRE 細(xì)胞中，Grin2d 及其上游調(diào)節(jié)因子 Ezh2 的缺失抑制了 EZH2-GRIN2D-TGFA 信號(hào)通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子（EGFR、E2F1、pCREB1 Ser133、TGFA）的表達(dá)水平（圖 S9H）。值得注意的是，外源性 L - 谷氨酸應(yīng)用無法完全恢復(fù)由 Grin2d 或 Ezh2 缺失引起的 E2F1 和 pCREB1 Ser133 的降低，而 TGFA 水平則部分恢復(fù)。相反，在 siNT 或 Grin2d?/? KPC-Pdx1CRE 細(xì)胞中，這些信號(hào)蛋白在谷氨酸刺激下顯著上調(diào)（圖 S9I、S9J）。

作者的 RNA-seq 分析顯示，小鼠胰腺癌細(xì)胞中 Grin2d 敲除導(dǎo)致 Cacna1h（Cav3.2，T 型鈣通道）基因下調(diào)和 Cacna1c（Cav1.2，L 型鈣通道）基因上調(diào)（圖 S9K）。相應(yīng)地，鈣成像顯示 Grin2d?/?細(xì)胞中鈣內(nèi)流完全消失，而 Grin2d?/?細(xì)胞中鈣內(nèi)流強(qiáng)烈（圖 S9L），這表明 Cacna1h 表達(dá)降低會(huì)功能性損害鈣進(jìn)入。鑒于 Cacna1h 在低閾值瞬時(shí)鈣內(nèi)流中的作用，盡管 Cacna1c 上調(diào)，但其缺失仍可能導(dǎo)致觀察到的信號(hào)缺陷。癌細(xì)胞常表現(xiàn)出由 L 型和 T 型電壓依賴性鈣通道（VdCCs）介導(dǎo)的自發(fā)性鈣內(nèi)流和膜去極化，這在與神經(jīng)元共培養(yǎng)的突觸后 PDAC 細(xì)胞中已觀察到。NMDA 受體激活依賴于谷氨酸結(jié)合，谷氨酸可能來源于特定微結(jié)構(gòu)域（即 “偽突觸”，類似于三方突觸）的局部釋放。NMDA 受體激活可產(chǎn)生額外的獨(dú)立鈣電流。VdCCs 引起的自發(fā)性鈣內(nèi)流活動(dòng)導(dǎo)致去極化，使 NMDA 受體更容易釋放 Mg2?阻斷。腫瘤環(huán)境中這種空間受限的谷氨酸能信號(hào)使 NMDA 受體局部激活和下游鈣信號(hào)傳導(dǎo)成為可能。這些發(fā)現(xiàn)支持一個(gè)模型：通過 VdCCs 的自發(fā)性去極化通過解除 Mg2?阻斷降低 NMDA 受體的激活閾值，其中含 GRIN2D 的 NMDA 受體介導(dǎo)谷氨酸依賴性鈣內(nèi)流，補(bǔ)充胰腺癌細(xì)胞中基線電壓依賴性鈣信號(hào)。這些發(fā)現(xiàn)表明 Grin2d 通過 Cacna1h 調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)，可能影響 KPC-Pdx1CRE 細(xì)胞的行為。對(duì) TCGA 數(shù)據(jù)集的進(jìn)一步分析顯示，CACNA1H 高表達(dá)與 PDAC 患者總生存期改善顯著相關(guān)（圖 S9M）。

綜上，本部分結(jié)果表明感覺神經(jīng)元消融后，Grin2d 敲除可影響 PDAC 腫瘤生長(zhǎng)、神經(jīng)浸潤(rùn)及相關(guān)疼痛感覺，且 Grin2d 通過調(diào)控鈣通道和相關(guān)信號(hào)通路參與 PDAC 進(jìn)展。

（七）感覺神經(jīng)元通過神經(jīng)元 - 癌癥偽突觸向人 PDAC 中的胰腺癌細(xì)胞提供谷氨酸

為探究神經(jīng)元釋放的谷氨酸是否能通過偽突觸信號(hào)激活胰腺癌細(xì)胞中的 NMDAR，作者利用透射電子顯微鏡（TEM）檢查了患者來源的 PDAC 標(biāo)本中突觸結(jié)構(gòu)的存在。TEM 掃描顯示了神經(jīng)浸潤(rùn)的兩種類型，即神經(jīng)內(nèi)浸潤(rùn)和神經(jīng)周浸潤(rùn)（圖 7A、S10A）。值得注意的是，在癌細(xì)胞周圍觀察到分散且分布明顯的神經(jīng)軸突（Ax），為神經(jīng)元 - 癌癥偽突觸結(jié)構(gòu)奠定了基礎(chǔ)（圖 7Aa1、7Aa2）。此外，作者發(fā)現(xiàn)高密度的突觸前終扣與侵犯的癌細(xì)胞接觸，其中既有大的致密核心小泡（可能含有神經(jīng)肽），也有小的突觸小泡（表明存在谷氨酸等分子神經(jīng)遞質(zhì)）（圖 7Ab）。

關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)是，在人 PDAC 樣本中，突觸后膜上清晰可見高度組織化的深色電子致密區(qū)域，即突觸后致密區(qū)（PSD）（圖 7B1-7B3）。這與中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中已知的興奮性突觸超微結(jié)構(gòu)一致，表明癌細(xì)胞膜上突觸后受體的集中，且連接到突觸后 GRIN2D 的神經(jīng)元突觸前具有釋放和接收機(jī)制的組件。

健康神經(jīng)中的軸 - 軸突觸很少見，僅在神經(jīng)橫切面上偶爾可見；然而，作者在神經(jīng)浸潤(rùn)部位發(fā)現(xiàn)了大量的神經(jīng)元 - 癌癥偽突觸，即使在較小的神經(jīng)單橫切面上也是如此（圖 7B）。TEM 圖像進(jìn)一步顯示了在這些神經(jīng)元 - 癌癥偽突觸中 GRIN1 和 SLC17A6 的免疫金染色（圖 7C）。

為量化潛在的偽突觸位點(diǎn)，作者測(cè)量了 19 個(gè)患者來源的 PDAC 標(biāo)本中 GRIN2D、PANCK 和 SLC17A6 的共定位位點(diǎn)，結(jié)果平均為 43.02±6.96 個(gè)偽突觸 /mm2（圖 S10B-S10D）。此外，作者觀察到，與植入 Grin2d?/?-KPC-Pdx1CRE 細(xì)胞的小鼠相比，植入 Grin2d?/?-KPC-Pdx1CRE 細(xì)胞的小鼠中，通過 DLG4、CK19 和 SLC17A6 共定位量化的潛在腫瘤偽突觸位點(diǎn)數(shù)量增加（19.00±2.36 vs. 9.71±1.77 個(gè)偽突觸 /mm2）（圖 S10E、S10F）。而且，Grin2d?/?-KPC-Pdx1CRE 腫瘤中突觸標(biāo)志物 DLG4、VAMP1 和 SLC17A6 的表達(dá)顯著低于 Grin2d?/?-KPC-Pdx1CRE 腫瘤（圖 S10G、S10H）。

與對(duì)人 PDAC 標(biāo)本的 TEM 分析一致，作者在體外進(jìn)一步觀察到，從轉(zhuǎn)染了 Slc17a6-RFP 的神經(jīng)元延伸出的軸突與轉(zhuǎn)染了 GRIN2D-GFP 的 SU.86.86 癌細(xì)胞之間形成了神經(jīng)元 - 癌癥偽突觸。這些偽突觸在神經(jīng)元 - 癌癥接觸位點(diǎn)周圍顯示出 SLC17A6 的分散分布（圖 S10I1、S10I2）。為在體外進(jìn)一步支持該假設(shè)，掃描電子顯微鏡（SEM）顯示了終末軸突與癌細(xì)胞形成的偽突觸（圖 7Da）。在這里，神經(jīng)軸突包裹并終止在癌細(xì)胞上，而癌細(xì)胞與突觸前和突觸后神經(jīng)元之間的突觸間隙相鄰，形成神經(jīng)元 - 癌癥偽突觸（圖 7Db），3D 重建視頻（Video S1）進(jìn)一步展示了這一現(xiàn)象。值得注意的是，神經(jīng)元 SLC17A6 紅色斑點(diǎn)與 SU.86.86 GRIN2D-GFP 表達(dá)緊密相關(guān)，顯示出神經(jīng)元 - 癌癥偽突觸的位點(diǎn)（圖 7E）。

綜上，本部分結(jié)果為神經(jīng)元和胰腺癌細(xì)胞建立偽突觸以促進(jìn)神經(jīng)元谷氨酸傳遞給癌細(xì)胞提供了有力證據(jù)。

本研究圍繞感官神經(jīng)元與胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）細(xì)胞的相互作用展開，首次證實(shí)了在腦外癌癥（PDAC）中感官神經(jīng)末梢與癌細(xì)胞之間存在偽突觸連接。研究發(fā)現(xiàn)，這些偽突觸中 NMDA 受體亞基 GRIN2D/GluN2D 選擇性富集，使 PDAC 細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元來源的谷氨酸產(chǎn)生應(yīng)答，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和擴(kuò)散。通過一系列體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，闡明了谷氨酸通過 GRIN2D 信號(hào)驅(qū)動(dòng) PDAC 進(jìn)展的分子機(jī)制，包括 CAMK IV-CREB 通路和 E2F1 介導(dǎo)的 EZH2 激活調(diào)控 GRIN2D 表達(dá)，以及 GRIN2D 觸發(fā) EGFR-TGFA 信號(hào)促進(jìn)腫瘤周圍神經(jīng)浸潤(rùn)等。同時(shí)，破壞偽突觸處谷氨酸 - GRIN2D 信號(hào)可顯著改善 PDAC 模型小鼠的生存狀況。此外，研究還發(fā)現(xiàn) GRIN2D 在多種人類癌癥中表達(dá)升高，暗示其可能具有更廣泛的臨床意義。該研究不僅揭示了 PDAC 進(jìn)展的新機(jī)制，還為開發(fā)以癌癥 - 神經(jīng)元偽突觸為靶點(diǎn)的癌癥神經(jīng)科學(xué)指導(dǎo)的腫瘤治療策略提供了重要理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。