1. 亞細胞定位
細胞內含有多種細胞器，如細胞核、線粒體、高爾基體、內質網、葉綠體、細胞膜、細胞質等，這些都可以被稱為“亞細胞”。蛋白通常分布在細胞內不同位置，實現(xiàn)機體不同功能。因此觀察其在細胞內的分布情況，是一種常見分子生物學手段，從而為研究基因的作用機制提供方向。
蛋白組在亞細胞中位置圖
2. 亞細胞定位實驗原理
通過基因工程手段，構建重組融合蛋白，將蛋白質構建到熒光蛋白的N端或C端。通過轉化技術或穩(wěn)定遺傳表達技術（常見的即農桿菌侵染），在受體材料中進行表達融合蛋白，熒光蛋白會受目的蛋白的牽引至相應的細胞器，在激光共聚焦顯微鏡下進行觀察，可獲得蛋白在細胞內的定位。
構建融合蛋白
3. 實驗流程
亞細胞定位流程示意圖
3.1 生物信息學分析
#序列比對
https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw
https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
http://bar.utoronto.ca/(特異性表達)
# 信號肽預測
https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-6.0
https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/
# 跨膜預測
https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0
# 亞細胞定位預測
https://ipsort.hgc.jp/
https://wolfpsort.hgc.jp/
http://cello.life.nctu.edu.tw/
3.2 實驗試劑及配方
（1）500 mM MES (pH 5.6)：稱取9.75g無水MES，用去離子水溶解，經NaOH調pH至5.6，定容至100mL，0.22 μm過濾器過濾除菌后，于4°C保存。
（2）100 mM 乙酰丁香酮：稱取0.196g乙酰丁香酮，用5mL DMSO (二甲基亞砜) 溶解，再用去離子水定容至 10mL，0.22μm過濾器過濾除菌后，分裝1mL至1.5 mL的EP管中，于-20 °C 保存。
（3）50 mg/mL Kana (母液)：稱取1 g的Kana粉末，用去離子水溶解并定容至20 mL，0.22 μm過濾器過濾除菌后，分裝1mL至1.5mL的EP管中，于-20 °C 保存。
（4）100 mg/mL Amp (母液)：稱取2 g的Amp粉末，用去離子水溶解并定容至20mL，0.22 μm過濾器過濾除菌后，分裝1mL至1.5 mL的EP管中，于-20 °C 保存。
（5）25 mg/mL Rif (母液)：稱取0.5 g的利福平粉末，用DMSO溶解并定容至20mL，不需要過濾除菌，直接分裝1 mL至1.5mL的EP管中，于-20 °C 保存。
（6）100 mM MgCl2：稱取1.0165 g的氯化鎂六水（BBI: A610328），用去離子水溶解并定容至50 mL，于4 °C保存。
100mL浸染液：2mL的500 mM MES + 0.15mL 的100 mM AS + 10 mL 100 mM MgCl2，用去離子水溶解定容至100mL即可。
（7）1 L的LB 培養(yǎng)基：5g酵母提取物 + 10g胰蛋白胨 + 10g NaCl，相應的抗生素工作濃度為50 mg/L Kana、100 mg/L Amp和25 mg/L Rif (母液)。
3.3 實驗步驟
- 種植煙草：在14h光照/10h黑暗，溫度25°C，相對濕度 70%條件下培養(yǎng)大概4～5周。
2.轉化農桿菌：將構建好的表達質粒轉化至農桿菌中（注：GV3101、EHA105、LBA4404 這三種農桿菌均有報道可以用于煙草瞬時轉化，在培養(yǎng)農桿菌時候除了添加載體所含有的抗生素外，不同農桿菌還需要添加其它種類抗生素，比如 GV3101 和EHA105還需要添加 50 μg/ml 的利福平）。 - 小搖菌種：挑取轉化有表達質粒的農桿菌克?。‥HA105）于1 mL含有相應抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，28℃搖床200rpm培養(yǎng)24 h。
- 大搖菌種：轉移1mL培養(yǎng)的農桿菌菌液至20mL含有相應抗生素的LB培養(yǎng)基中，該LB培養(yǎng)基含15μM乙酰丁香酮（20 mL的LB中加入3 μL的100 mM AS）。在28 °C，200 rpm的條件下培養(yǎng)至農桿菌生長的對數(shù)期(OD600 = 0.5-0.6)。
5.處理菌種：以室溫，5,000rpm條件離心10 min以收集菌體，用浸染液 (含10 mM MgCl2, 10 mM MES，150 μM乙酰丁香酮，pH = 5.6)懸浮農桿菌菌體至OD600 = 1.0。室溫靜止2～3 h (至少 0.5 h，至多不超過3 h)。 - 等體積混合兩種含有不同質粒的菌體，用1 mL的針頭在煙草葉片背面輕輕點開一個小口 (注意不要刺穿)，再用去掉針頭的針管吸取菌液，從葉片傷口處注射到葉片中（如圖1-2：以手指抵住葉片正面，將菌液從葉片的背面滲透進去）。用記號筆標記煙草葉片水漬狀區(qū)域。
7.注射過的植株于黑暗下放置12h，然后于21°C左右培養(yǎng)至2d后觀察煙草注射農桿菌的區(qū)域有無熒光，撕取煙草葉片標記區(qū)域 (可以不撕，直接用刀挖出靠近傷口的葉片部分即可) 用激光共聚焦顯微鏡進行熒光的成像 (葉片背面表皮細胞層較好觀察)。
3.4注意事項
1.選擇健康、處于壯年的煙草葉片進行注射，幼嫩或皺縮葉片不易注射，衰老葉片的表達效率較低。葉片氣孔打開的時候比較容易注射，因此最好在白天注射。
2.農桿菌菌液濃度是需要自己摸索的一個參數(shù)，OD600 = 1.0并不一定適用于所有的基因，高濃度可能導致葉片死亡，或者影響定位結果，建議設置不同濃度梯度進行比較，在可以獲得熒光信號的前提下盡量采用低濃度的菌液。
- 不同外源基因的瞬時表達效率大不相同，這一點在單轉做亞細胞定位的時候表現(xiàn)得特別明顯，效率高者基本每次都能達到100%發(fā)光，低者可能轉10次只能表達出一兩次，建議在BiFC之前先做個亞細胞定位評價一下兩個基因的表達效率，以便調整兩個質粒的轉化條件。
4.注射后的植株通常在2d之后觀察，但不同基因表達的時間可能在1-7天不等。
5.轉化效率低：需注意農桿菌的活性，建議侵染煙草葉片的農桿菌OD600值為0.6；
6.受體材料時期選擇：擬南芥移栽之后3-4周可以做原生質體、生長4-5周的煙草苗比較適合注射（盡量選擇頂部，不要移栽）。
