摘要：為明確帚枝霉屬內(nèi)生真菌Sarocladium brachiariae?HND5菌株具體的抑菌活性物質(zhì)，在全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)對(duì)抑菌活性物質(zhì)合成基因簇進(jìn)行定位，通過聚類分析和系統(tǒng)發(fā)育樹分析對(duì)基因簇合成產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，并通過基因缺失突變構(gòu)建及代謝組分析確定具體的抑菌活性物質(zhì)。結(jié)果顯示，HND5菌株共含有7個(gè)非核糖體多肽合成酶（non-ribosomal peptide synthe‐tase，NRPS）基因簇，聚類分析結(jié)果表明基因簇29合成產(chǎn)物為噬鐵素，基因簇30合成產(chǎn)物為類環(huán)孢霉素類抗菌多肽；系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)合生物信息學(xué)結(jié)果顯示基因簇30合成產(chǎn)物與已知環(huán)孢霉素結(jié)構(gòu)差異大，為一個(gè)新型非核糖體多肽；將基因簇30?NRPS基因缺失突變后，HND5菌株喪失抑菌活性；同野生型菌株相比，基因簇30?NRPS基因缺失突變體缺失一個(gè)分子量為887.54 Da的多肽類物質(zhì)。表明HND5菌株的抑菌活性物質(zhì)為一個(gè)分子量為887.54 Da的新型類環(huán)孢霉素非核糖體多肽，基因簇30負(fù)責(zé)該多肽的生物合成。

關(guān)鍵詞：內(nèi)生真菌；香蕉枯萎病菌；抑菌多肽；非核糖體多肽合成酶

尖孢鐮刀菌古巴專化型4號(hào)生理小種Fusarium oxysporum?f.sp.cubense?Race 4（FOC4）引起的香蕉枯萎病已經(jīng)在全球多個(gè)產(chǎn)區(qū)暴發(fā)，嚴(yán)重威脅著香蕉產(chǎn)業(yè)發(fā)展，生物防治因綠色環(huán)保、無(wú)殘留而備受青睞（Fravel et al.，2003；Thangavelu ＆ Mustaffa，2010；Akila et al.，2011）。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種生防菌株可以防治FOC4，如解淀粉芽胞桿菌Bacillus amyloliquefaciens?NJN-6和BEB33、枯草芽胞桿菌B. subtilis?BEB2（付業(yè)勤等，2009；朱森林等，2014），鏈霉菌Streptomyces albulus?NJZJSA2（Wu et al.，2015）、多產(chǎn)色鏈霉菌S.polychromogenes?和綠色木霉Trichoderma viride等（周登博等，2016））。除上述根圍微生物外，內(nèi)生菌因其獨(dú)特的生態(tài)位也在生物防治中發(fā)揮著重要作用，如從野生酸棗中分離得到的芽胞桿菌SZG-23（裴淑蘭等，2018）、從楊樹中分離得到的黃綠木霉T.aureoviride（楊蕾等，2014）及從石斛中分離得到的解淀粉芽胞桿菌（何勁等，2014）等。有關(guān)內(nèi)生菌生防活性物質(zhì)及生防機(jī)理的報(bào)道較少，限制了其開發(fā)利用。陳奕鵬等（2017）和霍珊珊（2012）從臂形草中分離得到的帚枝霉屬內(nèi)生真菌Sarocladium brachiariae?HND5 菌株可有效抑制FOC4 的生長(zhǎng)，明確該菌株的活性物質(zhì)對(duì)其推廣有重要意義。

真菌生防活性物質(zhì)主要包括多肽類、聚酮類、萜類、生物堿類和揮發(fā)性物質(zhì)等，具有抗菌、殺蟲和抗病毒等多種功能（Aly et al.，2011），其中非核糖體多肽合成酶（non-ribosomal peptide synthetase，NRPS）合成的非核糖體多肽類次生代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)和功能具有多樣性，是活性物質(zhì)的重要組成部分（Walsh et al.，2001；Bills et al.，2014）。在已報(bào)道的真菌全基因組數(shù)據(jù)中，尚有90%非核糖體多肽及其相關(guān)合成基因功能未知（Nielsen et al.，2017）。真菌基因組中的非核糖體多肽相關(guān)合成基因以基因簇的形式存在，可利用antiSMASH等在線工具對(duì)其進(jìn)行定位分析（Weber et al.，2015；Ebert et al.，2018）。NRPS 由多個(gè)相對(duì)獨(dú)立的功能域組成，其中腺苷?；δ苡蛞蚱湫蛄斜Ｊ兀１挥糜谖粗δ躈RPS 基因簇的進(jìn)化分析及產(chǎn)物預(yù)測(cè)（Bushley＆Turgeon，2010）。

帚枝霉屬主要由水稻鞘腐病菌Sarocladium oryzae、尖狹帚枝霉S. attenuatum?和紫色帚枝霉S.sinense?等水稻病原菌，基利帚枝霉S.kiliense、直立帚枝霉S.strictum?等人類病原菌以及植物內(nèi)生菌組成（Giraldo et al.，2015；Liu et al.，2017）。目前，僅從水稻鞘腐病菌發(fā)酵液上清液中分離得到淺藍(lán)菌素和煙曲霉酸2種植物毒素，其它類型次生代謝產(chǎn)物未見報(bào)道（Bigirimana et al.，2015）。鐮刀菌屬和頂孢霉屬與帚枝霉屬親緣關(guān)系最近，Anisha ＆ Rad‐hakrishnan（2015）從頂孢霉屬中分離得到抗菌物質(zhì)環(huán)孢霉素和gliotoxin等非核糖體多肽類次生代謝產(chǎn)物，Bahadoor et al.（2018）從禾谷鐮刀菌F. graminearum?中分離得到合成的寄主專化型毒素gra‐millin等非核糖體多肽類次生代謝產(chǎn)物。Hittalmani et al.（2016）全基因組測(cè)序結(jié)果顯示，水稻鞘腐病菌基因組中含有7 個(gè)NRPS 基因簇，10 個(gè)聚酮類合成酶-非核糖體多肽合成酶雜合基因簇，表明該屬真菌具有合成多種非核糖體多肽類次生代謝產(chǎn)物的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。因此，研究非核糖體多肽類次生代謝產(chǎn)物，可進(jìn)一步推動(dòng)帚枝霉屬真菌生防機(jī)理的研究。

為進(jìn)一步明確帚枝霉屬內(nèi)生真菌HND5菌株的抑菌活性物質(zhì)，本研究擬在全基因組數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)對(duì)抑菌活性物質(zhì)合成基因簇進(jìn)行定位，采用聚類分析和系統(tǒng)發(fā)育樹分析對(duì)基因簇產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，并通過基因缺失突變體的構(gòu)建及代謝組分析確定具體的抑菌活性物質(zhì)，以期為該內(nèi)生真菌菌株生防機(jī)理的解析及實(shí)際應(yīng)用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：帚枝霉屬內(nèi)生真菌HND5菌株（My‐coBank 登錄號(hào)MB814539），植物病原菌多主棒孢Corynespora cassiicola、尖孢鐮刀菌、FOC4 均由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所提供。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉15~20 g、去離子水1 L；馬鈴薯葡萄糖（pota‐to dextrose，PD）液體培養(yǎng)基：PDA 培養(yǎng)基中不添加瓊脂粉；完全培養(yǎng)基（complete medium，CM）：酵母浸膏6 g、酶水解干酪素3 g、酸水解干酪素3 g、蔗糖10 g，蒸餾水定容至1 L；再生培養(yǎng)基：酵母浸膏1 g、酶水解干酪素1 g、蔗糖342 g，蒸餾水定容至1 L。

試劑及儀器：TransStart FastPfu DNA Poly‐merase，全式金生物技術(shù)（北京）有限公司；限制性內(nèi)切酶，寶生物工程（大連）有限公司；酶水解干酪素、酸水解干酪素、酵母浸膏，索萊寶（北京）科技有限公司；胰蛋白胨、酵母粉，英國(guó)OXOID 公司；DS2000 Marker，天根生化科技（北京）有限公司；Southern blot 試劑盒，瑞士羅氏生命科學(xué)公司；色譜純甲醇，賽默飛世爾（中國(guó)）科技有限公司；XAD-16 大孔樹脂，美國(guó)西格瑪奧德里奇公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。ACQUITY UPLC-I超高效液相色譜儀、Xevo G2-XS TOF 飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜儀，沃特世科技（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 HND5菌株NRPS基因簇預(yù)測(cè)與注釋

利用在線分析工具antiSMASH 3.0（https://fungismash.secondarymetabolites.org）使用默認(rèn)值對(duì)HND5菌株的全基因組進(jìn)行次生代謝產(chǎn)物預(yù)測(cè)。在antiSMASH 預(yù)測(cè)結(jié)果的基礎(chǔ)上，利用BLASTp 軟件（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE=Pro‐teins）分析NRPS基因簇中全部基因的保守功能域，并對(duì)HND5菌株基因簇30進(jìn)行詳細(xì)注釋。

1.2.2 HND5菌株NRPS產(chǎn)物的聚類分析

通過與已知功能和產(chǎn)物的NRPS腺苷?；鶊F(tuán)的聚類分析來鑒定HND5菌株NRPS的功能和合成產(chǎn)物。根據(jù)antiSMASH 預(yù)測(cè)分析結(jié)果，獲得HND5菌株NRPS 中腺苷?；鶊F(tuán)的氨基酸序列；參照Bushley＆Turgeon（2010）方法，獲得已知產(chǎn)物和功能的NRPS中腺苷?；鶊F(tuán)氨基酸序列。使用MEGA 6.0 軟件對(duì)HND5 菌株中未知功能及已知功能的NRPS 腺苷?；鶊F(tuán)進(jìn)行排序，采用最大似然法進(jìn)行聚類分析，1 000次重復(fù)（Tamura et al.，2013）。

1.2.3 基因簇30 NRPS產(chǎn)物的系統(tǒng)發(fā)育樹分析

恩鐮孢霉素合成酶及環(huán)孢霉素合成酶均具有較好的抑菌活性，對(duì)基因簇30 中NRPS 的腺苷酰化基團(tuán)與環(huán)孢霉素合成酶及其同源合成酶的腺苷?；鶊F(tuán)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。參照Bushley et al.（2013）方法獲得環(huán)孢霉素合成酶及其同源合成酶的腺苷?；δ苡虬被嵝蛄?，利用MEGA 6.0 軟件對(duì)序列進(jìn)行排序，并采用最大似然法構(gòu)建基因簇30中NRPS、環(huán)孢霉素合成酶及其同源合成酶中的腺苷?；δ苡虻南到y(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 基因簇30?NRPS基因缺失突變體的構(gòu)建與驗(yàn)證

使用Split-marker 方法進(jìn)行基因簇30?NRPS?基因缺失突變體的構(gòu)建（Catlett et al.，2003）。首先以HND5 菌株基因組為模板，利用引物C30-L-F（5′-GATGAGGCTATGCAGTTGACTGTAG-3′?）/C30-LR（5′-CCAAGCCCAAAAAGTGCTCCTTCAATATCAAGATTGGAGAAATTCGGCCAGAGCT-3′）擴(kuò)增獲得目的片段左同源臂，利用引物C30-R-F（5′-AGGGCAAAGGAATAGAGTAGATGCCGACCGCTGCATCCAGTCCCCGACCATCATC-3′?）/C30-R-R（5′-TCTTTTGCCACTCACAGCGGGAGTC-3′）擴(kuò)增獲得目的片段右同源臂；以pSilent-1載體為模板，利用引物HYG-F（5′-GAGCTCGGCTTGGCTGGAGC‐TAGTGGAGGTC-3′）/HY-R（5′-GGATCCGTCTTGACCGATTCCTTGCGGTCCG-3′）擴(kuò)增獲得潮霉素抗性基因5′端，利用引物YG-F（5′-GAGCTCGATG‐TAGGAGGGCGTGGATATGTCC-3′）/HYG-R（5′-GGATCCTCGAATTCGTCGACGTTAACTGGCT-3′?）擴(kuò)增獲得潮霉素抗性基因3′端；采用重疊PCR方法，利用引物C30-L-F（5′-GATGAGGCTATGCAGTT‐GACTGTAG-3′）/HY-R（5′-GGATCCGTCTTGACC‐GATTCCTTGCGGTCCG-3′）連接目的片段左同源臂和潮霉素抗性基因5′端，得到突變左臂；同樣采用重疊PCR方法，利用引物YG-F（5′-GAGCTCGATG‐TAGGAGGGCGTGGATATGTCC-3′）/C30-R-R（5′-T CTTTTGCCACTCACAGCGGGAGTC-3′）連接目的片段右同源臂和潮霉素抗性基因3′端，得到突變右臂。引物均由華大基因科技服務(wù)（深圳）有限公司合成。利用CM培養(yǎng)基制備HND5菌株原生質(zhì)體感受態(tài)，同時(shí)轉(zhuǎn)入相等摩爾數(shù)的突變左臂和右臂，涂布到含濃度150 μg/mL潮霉素的再生培養(yǎng)基篩選平板，挑取抗潮霉素的HND5 菌株轉(zhuǎn)化子，并提取轉(zhuǎn)化子基因組，利用突變體引物對(duì)C30-Test-F（5′-GAGAAGT‐GTGCAAATGGTGTCGTCG-3′）/C30-Test-R（5′-GGTCAACATAGCTTTCGACGTCTCG-3′）以及C30-T-F（5′-GCCCGTCTCCCTTGCCAGTGATAT-3′）/HYR（5′-GGATCCGTCTTGACCGATTCCTTGCGGTCCG-3′）對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行PCR 檢測(cè)以確定插入位置的正確性。PCR 體系均按照TransStart FastPfu DNA Polymerase 構(gòu)建?；虼?0?NRPS?基因左右臂，HYG?左右臂擴(kuò)增以及轉(zhuǎn)化子檢測(cè)PCR 程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性20 s；58℃退火20 s；72℃延伸20 s；循環(huán)30 次；72℃延伸10 min。HYG左右臂與目的基因左右臂重疊PCR 程序分2 步，第1 步PCR，不添加引物：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性20 s；58℃退火20 s；72℃延伸45 s；循環(huán)5次；72℃延伸5 min；第2 步PCR，向第1 步PCR 體系中加入引物：95℃預(yù)變性5 min；2：95℃變性20 s；68℃至48℃，每個(gè)循環(huán)降低1℃；72℃延伸45 s；循環(huán)20次。使用被突變的腺苷酰化功能域片段和HYG 片段設(shè)計(jì)的探針進(jìn)行Southern blot 雜交，并按照Southern blot試劑盒說明書進(jìn)行Southern blot檢測(cè)，當(dāng)插入片段個(gè)數(shù)為1時(shí)，即得到突變體。

1.2.5 基因簇30?NRPS基因缺失突變體的抑菌活性

利用400 mL PD液體培養(yǎng)基發(fā)酵野生型HND5菌株和基因簇30?NRPS?基因缺失突變體，28℃搖床暗培養(yǎng)21 d；利用XAD-16 大孔樹脂抽提發(fā)酵液上清中的次生代謝產(chǎn)物，用甲醇洗脫；洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸干后使用1 mL甲醇溶解，獲得野生型HND5菌株及突變體的次生代謝產(chǎn)物。采用平板對(duì)峙法檢測(cè)次生代謝產(chǎn)物的抑菌活性，在PDA平板中間分別接種直徑2 mm的多主棒孢、尖孢鐮刀菌和FOC4菌餅，在菌餅周圍放置3張直徑5 mm的濾紙片，每張濾紙片分別滴加5μL色譜純甲醇（陰性對(duì)照）、野生型HND5菌株的次生代謝產(chǎn)物及基因簇30?NRPS基因缺失突變體的次生代謝產(chǎn)物，28℃培養(yǎng)5~7 d，根據(jù)菌絲的生長(zhǎng)情況確定突變體次生代謝產(chǎn)物的抑菌活性。

1.2.6 代謝組分液相色譜聯(lián)合質(zhì)譜分析

使用色譜儀和質(zhì)譜儀對(duì)野生型HND5菌株和基因簇30?NRPS?基因缺失突變體的代謝組分進(jìn)行分析。使用ACQUITYUPLC BEH色譜柱進(jìn)行物質(zhì)分離，流動(dòng)相A 為水，流動(dòng)相B 為色譜純甲醇，流速為0.3 mL/min，進(jìn)樣量為5μL。梯度洗脫程序：0~1 min，5%B；1~7 min，5%~30%B；7~7.5 min，30%~95%B；7.5~10 min，95%~5%B；10~15 min，5%B。質(zhì)譜使用電噴霧電離方式，檢測(cè)范圍為10~1 200 Da。使用MassLynx 4.1 軟件中的Progenesis QI 2.0 插件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 HND5菌株NRPS基因簇的預(yù)測(cè)與注釋

antiSMASH 分析結(jié)果顯示，HND5 菌株基因組存在31 個(gè)次生代謝產(chǎn)物基因簇，其中NRPS 基因簇有7 個(gè)。通過對(duì)這7 個(gè)基因簇進(jìn)行注釋發(fā)現(xiàn)，除NRPS基因外，基因簇中還含有產(chǎn)物修飾、調(diào)控和轉(zhuǎn)運(yùn)等相關(guān)基因（圖1），是典型的NRPS合成基因簇。

圖1 HND5菌株基因組中非核糖體多肽合成酶基因簇注釋示意圖

2.2 HND5菌株NRPS基因簇產(chǎn)物的鑒定

聚類分析結(jié)果顯示，基因簇29 中的NRPS 的腺苷?；δ苡蚰芘c噬鐵素合成酶的腺苷酰化功能域聚類，基因簇30 的NRPS 的腺苷?；δ苡蚰芘c環(huán)孢霉素合成酶的腺苷?；δ苡蜻M(jìn)行聚類，且均有50%以上的靴值支撐（Bootstrap=1 000），其它基因簇中的NRPS 腺苷酰化功能域無(wú)法與已知功能的NPRS 腺苷?；δ苡蚓垲悾▓D2）。因此HND5 菌株中的7 個(gè)NRPS 基因簇中基因簇29 和基因簇30可能為合成產(chǎn)物，其中基因簇29合成產(chǎn)物可能是噬鐵素類物質(zhì)，基因簇30 合成產(chǎn)物可能是環(huán)孢霉素類物質(zhì)。

圖2 HND5菌株中非核糖體多肽合成酶的腺苷酰化功能域與已知功能非核糖體多肽合成酶腺苷?；δ苡虻木垲惙治?

陰影：目標(biāo)腺苷酰化功能域。Shadow label：target adenylation（A）domains.

2.3 HND5菌株基因簇30產(chǎn)物的鑒定

在HND5 菌株NRPS 基因簇功能鑒定的基礎(chǔ)上，對(duì)基因簇30 NRPS 進(jìn)行進(jìn)一步的注釋和功能鑒定。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，基因簇30 NPRS 的2個(gè)腺苷?；鶊F(tuán)與恩鐮孢霉素合成酶腺苷?；δ苡蛲搓P(guān)系最近，其它5 個(gè)腺苷?；δ苡蚺c環(huán)孢霉素合成酶腺苷酰化功能域有較好的同源關(guān)系（圖3）。盡管系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示基因簇30 NRPS與恩鐮孢霉素合成酶及環(huán)孢霉素合成酶具有較近的遺傳關(guān)系，但是其功能域結(jié)構(gòu)與環(huán)孢霉素合成酶、恩鐮孢霉素合成酶的功能域結(jié)構(gòu)明顯不同：基因簇30 NRPS由2個(gè)開放閱讀框組成，且有1個(gè)單獨(dú)的腺苷?；δ苡颍▓D4）?；虼?0 的詳細(xì)注釋結(jié)果顯示，該基因簇中含有1 個(gè)1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylate，ACC）合成酶基因，該基因在已知NRPS基因簇中未報(bào)道過，是一個(gè)新型非核糖體多肽修飾酶。

圖3 基于最大似然法構(gòu)建基因簇30中非核糖體多肽合成酶腺苷酰化功能域與環(huán)孢霉素合成酶及其同源合成酶腺苷?；δ苡虻南到y(tǒng)發(fā)育樹

圖4 基因簇30中非核糖體多肽合成酶功能域結(jié)構(gòu)與環(huán)孢霉素合成酶及其同源合成酶功能域結(jié)構(gòu)的比較

2.4 HND5菌株NRPS基因缺失突變體

采用Split-marker 方法獲得多個(gè)HND5 菌株的基因簇30?NRPS?基因缺失轉(zhuǎn)化子；PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化子無(wú)法擴(kuò)增到被突變片段而能擴(kuò)增HYG基因片段（圖5）；Southern blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，野生型HND5菌株可以獲得一條腺苷?；鶊F(tuán)基因探針雜交條帶，潮霉素抗性基因探針沒有雜交條帶；而使用腺苷?；鶊F(tuán)基因探針雜交轉(zhuǎn)化子無(wú)條帶，潮霉素抗性基因探針雜交轉(zhuǎn)化子可得到一個(gè)條帶（圖6），表明HND5菌株基因簇30?NRPS基因缺失突變體構(gòu)建成功。

圖5 HND5菌株基因簇30非核糖體多肽合成酶基因缺失突變體的PCR檢測(cè)

A：利用引物C30-Test-F/C30-Test-R 擴(kuò)增基因簇30 中NRPS?基因被突變的片段；B：利用引物C30-T-F/HY-R PCR 檢測(cè)HYG插入位置。M：DS2000 marker；1：陰性對(duì)照；2~6：cluster 30中NRPS基因缺失突變轉(zhuǎn)化子；7：野生型HND5菌株。A：Amplification of the mutated fragment of the?NRPS?gene of cluster 30 by using the primers C30-Test-F/C30-Test-R；B：PCR test of?HYG?gene insertion position by using the primers C30-T-F/HY-R. M：DS2000 marker；1：negative control；2-6：cluster 30?NRPS?encoding gene mutants；7：wild type strain of HND5.

圖6 HND5菌株基因簇30非核糖體多肽合成酶基因缺失突變體的Southern blot驗(yàn)證

A：NRPS基因缺失部分檢測(cè)探針；B：HYG檢測(cè)探針。M：λ-Hind III marker；1：HND5菌株基因組Hind III酶切產(chǎn)物；2~5：cluster 30?NRPS基因缺失突變體基因組Hind III酶切產(chǎn)物。A：Probe for mutated fragment detection；B：probe for?HYG?gene detection.M：λ-Hind III marker；1：Hind III digested fragment of genomic DNA of wild type strain HND5；2-5：Hind III digested fragment of genomic DNA of cluster 30?NRPS?gene mutant of HND5 strain.

2.5 HND5菌株NRPS基因突變體的抑菌活性

平板抑菌試驗(yàn)顯示，野生型HND5 菌株發(fā)酵液上清液提取物可有效抑制多主棒孢、尖孢鐮刀菌和尖孢鐮刀菌古巴?；?號(hào)生理小種3種病原菌的生長(zhǎng)，而HND5 菌株基因簇30?NRPS?基因突變體發(fā)酵液上清液提取物不能抑制3種真菌的生長(zhǎng)（圖7），表明NRPS基因參與合成的非核糖體多肽，是HND5菌株主要的抗真菌活性物質(zhì)。

圖7 野生型HND5菌株和基因簇30非核糖體多肽合成酶基因缺失突變體的抑菌活性

A~C：多主棒孢、尖孢鐮刀菌、尖孢鐮刀菌古巴專化型4 號(hào)生理小種；CK：甲醇。A-C：Corynespora cassiicola，F(xiàn)usarium oxysporum，F(xiàn).oxysporum?f.sp.cubense?Race 4，respectively；CK：methanol.

2.6 代謝組分的液相色譜聯(lián)合質(zhì)譜分析

與野生型HND5 菌株代謝組分相比，基因簇30?NRPS?基因缺失突變體代謝組分缺失了1 種質(zhì)核比為887.54 的物質(zhì)。一級(jí)質(zhì)譜圖顯示，野生型HND5菌株和基因簇30?NRPS基因缺失突變體均在8.53 min處出現(xiàn)峰值（圖8-A~B）；二級(jí)質(zhì)譜圖顯示，野生型HND5 菌株和基因簇30?NRPS基因缺失突變體在相同碰撞能量下的二級(jí)質(zhì)譜碎片完全不同，其中野生型HND5 菌株的碎片質(zhì)核比為409.17，而基因簇30?NRPS基因缺失突變體的碎片質(zhì)核比為782.57（圖8-C~D），表明兩者雖然分子量相似，但是是不同的物質(zhì)。

圖8 野生型HND5菌株（A、C）和基因簇30非核糖體多肽合成酶基因缺失突變體（B、D）代謝組分子量為887.54 Da的質(zhì)譜圖

3 討論

本研究根據(jù)生防內(nèi)生真菌HND5菌株全基因組數(shù)據(jù)，利用antiSMASH 鑒定得到了7 個(gè)NRPS 基因簇；Hittalmani et al.（2016）通過全基因組測(cè)序從水稻鞘腐病菌基因組中也鑒定得到7 個(gè)NRPS 基因簇，但未進(jìn)行功能驗(yàn)證和產(chǎn)物鑒定，說明該屬真菌具有合成多種非核糖體多肽類次生代謝產(chǎn)物的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。本研究的腺苷?；δ苡蚓垲惙治鼋Y(jié)果顯示，HND5菌株基因簇29的產(chǎn)物為噬鐵素，基因簇30的產(chǎn)物為環(huán)孢霉素類物質(zhì)。噬鐵素類物質(zhì)是一類重要的植物促生長(zhǎng)物質(zhì)，可促進(jìn)植物對(duì)鐵元素的吸收（Winterberg et al.，2010），說明HND5 菌株具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)的潛力。本研究?jī)H關(guān)注了基因簇30 合成的環(huán)孢霉素類抗菌物質(zhì)，在今后的研究中將對(duì)HND5菌株噬鐵素的促生效果進(jìn)行進(jìn)一步探討。

環(huán)孢霉素是頂孢霉屬真菌Acremonium luzulae產(chǎn)生的主要抗菌物質(zhì)，如環(huán)孢霉素C（Moussa?f et al.，1997）。Giraldo et al.（2015）的多基因序列進(jìn)化分析結(jié)果顯示，帚枝霉屬與頂孢霉屬親緣關(guān)系近，原來多個(gè)頂孢霉屬真菌重新被鑒定為帚枝霉屬真菌，如基利頂孢霉Acremonium kiliense?被重新鑒定為帚枝霉屬。本研究結(jié)果表明帚枝霉屬內(nèi)生真菌HND5菌株基因簇30 的可能產(chǎn)物為環(huán)孢霉素類物質(zhì)，與Giraldo et al.（2015）結(jié)果一致。Yang et al.（2018）研究結(jié)果顯示，彎頸霉屬中環(huán)孢霉素合成基因簇共有1個(gè)細(xì)胞色素P450、1個(gè)丙氨酸異構(gòu)酶和1個(gè)氨基轉(zhuǎn)移酶參與了環(huán)孢霉素的生物合成過程，而本研究結(jié)果表明在HND5 菌株基因簇30 中，僅含有1 個(gè)細(xì)胞色素P450和1個(gè)ACC合成酶編碼基因，與已知的環(huán)孢霉素生物合成基因簇差別明顯；且基因簇30 中NRPS的功能域結(jié)構(gòu)與環(huán)孢霉素合成酶的功能域結(jié)構(gòu)明顯不同（Nilanonta et al.，2003），是一種新型類環(huán)孢霉素多肽。后期還需對(duì)該多肽的具體化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步解析。

含有環(huán)丙基結(jié)構(gòu)的氨基酸在非核糖體多肽中存在較少，目前僅在假單胞病原菌合成的冠菌素中發(fā)現(xiàn)含有冠烷酸（coronamic acid，1-amino-1-carboxy-2-ethylcyclopropane，CMA）這種環(huán)丙基氨基酸。假單胞菌通過非血紅素鐵酶催化的氯化反應(yīng)，可以亮氨酸為底物合成CMA（Vaillancourt et al.，2005；Tang et al.，2017）。本研究在HND5 菌株基因簇30中發(fā)現(xiàn)l 個(gè)ACC 合成酶編碼基因，該基因表達(dá)產(chǎn)物可以S-腺苷蛋氨酸作為底物合成含有環(huán)丙基結(jié)構(gòu)的ACC（Zhang et al.，2004）。推測(cè)ACC 可能作為基因簇30中非核糖體多肽的底物參與產(chǎn)物的合成，為一種新發(fā)現(xiàn)的含有環(huán)丙基結(jié)構(gòu)的NRPS 的底物氨基酸。該結(jié)果僅是生物信息學(xué)的分析結(jié)果，還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

缺失突變體構(gòu)建是非核糖體多肽鑒定及合成途徑解析的主要研究手段。Wang et al.（2012）通過構(gòu)建綠僵菌Metarhizium?的相關(guān)突變體解析了綠僵菌素的生物合成途徑；Guo et al.（2013）在基因組數(shù)據(jù)的指導(dǎo)下構(gòu)建了土曲霉Aspergillus terreus的相關(guān)突變體，通過構(gòu)建的突變體成功解析了多硫代二酮哌嗪類物質(zhì)的合成機(jī)理。本研究利用Split-marker 方法構(gòu)建了HND5菌株基因簇30?NRPS基因缺失突變體，并使用PCR 技術(shù)及Southern blot 兩種方法對(duì)突變體進(jìn)行驗(yàn)證，保證了結(jié)果的可靠性。超高效液相色譜、飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜分析具有高靈敏度、高準(zhǔn)確度及高分辨率等優(yōu)點(diǎn)，可對(duì)微生物代謝產(chǎn)物進(jìn)行全面精確的檢測(cè)，如元超等（2018）就采用此方法對(duì)地衣內(nèi)生真菌Pestalotiopsis?sp.次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分析。本研究將突變體構(gòu)建和液相色譜聯(lián)合質(zhì)譜檢測(cè)相結(jié)合，準(zhǔn)確定位了HND5 菌株基因簇的合成產(chǎn)物，為內(nèi)生真菌“從基因到產(chǎn)物”（Cacho et al.，2015）的研究提供了新方法。

在全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)的支持下，本研究定位了生防內(nèi)生真菌HDN5 菌株抗菌物質(zhì)合成相關(guān)的NRPS 基因簇，并通過質(zhì)譜分析定位到了該基因簇的合成產(chǎn)物，但該物質(zhì)的具體結(jié)構(gòu)未解析，合成基因簇中的ACC 修飾功能未知。下一步工作中將對(duì)該抑菌非核糖體多肽進(jìn)行進(jìn)一步鑒定和結(jié)構(gòu)解析，并通過分析基因簇中修飾酶功能解析該非核糖體多肽的合成機(jī)理。

免責(zé)聲明：本文為行業(yè)交流學(xué)習(xí)，版權(quán)歸 原作者所有，如有侵權(quán)，可聯(lián)系刪除。