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  • 可以對比一下BIOG的操作:1.請自行準備:無水乙醇、15mL離心管。
    2.取出洗滌液,按以下操作:
    a) 洗滌液A:31.5mL加入13.5mL無水乙醇;63mL加入27mL無水乙醇。
    b) 洗滌液B:13.5mL加入31.5mL無水乙醇;27mL加入63mL無水乙醇。
    c) 配制好的洗滌液如出現(xiàn)沉淀,可在37℃溶解,搖勻后使用。
    3.取15mL離心管,加入1500μL樣本,30μLDNA Carrier混合均勻,加入1500μL 裂解液及150μL 消化液,振蕩混勻,56℃水浴10 分鐘。
    4.加入6000μL無水乙醇,輕輕顛倒混勻,如有半透明懸浮物,不影響DNA的提取與后續(xù)實驗。
    5.將吸附柱放入收集管內,將4590μL上述溶液轉入吸附柱內,靜置2 分鐘,5,000 rpm 離心2分鐘,棄收集管內廢液;
    6.將吸附柱放回收集管內,將剩余4590μL溶液轉移至吸附柱內,重復步驟5。
    7.將吸附柱放回收集管內,加3750μL 洗滌液A至吸附柱內,5,000 rpm 離心1 分鐘,棄收集管內廢液。
    8.將吸附柱放回收集管內,加3750μL 洗滌液B至吸附柱內,5,000 rpm 離心1 分鐘,棄收集管內廢液。
    9.將吸附柱放回收集管內,5,000 rpm 離心2 分鐘,離去殘留的洗滌液。
    10.取出吸附柱,放入新的15 mL離心管內,加入250-400μL 洗脫液,靜置3 分鐘,5,000 rpm離心3 分鐘,收集DNA溶液。提取的DNA即可用于下一步實驗或-20℃保存。如需濃縮核酸,則可繼續(xù)進行后續(xù)步驟。
    11.于洗脫液中加入800ul無水乙醇,輕輕顛倒混勻,5,000 rpm 離心5分鐘,棄上清。
    12.開蓋室溫放置5min,待乙醇揮發(fā)后,加入30-50ul洗脫液溶解核酸。提取的DNA即可用于下一步實驗或-20℃保存。

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    2.過夜培養(yǎng)。
    B. DeofectEU /DNA復合物包裝(該步完成后應立即轉染):
    1.在1.5 ml無菌離心管中加入50μl無血清培養(yǎng)基,并添加適量的轉染試劑(2~5μl/μg DNA,參見下表) 。用移液器輕輕混勻后在室溫靜置5~10分鐘。
    2.在1.5 ml無菌離心管中加入50μl無血清培養(yǎng)基,并添加適量的DNA (0.8~1μgDNA/孔, 參見附表)。用移液器輕輕混勻后在室溫靜置5~10分鐘。
    3.將DeofectEU-培養(yǎng)基混合物滴加至DNA-培養(yǎng)基混合物中,用移液器輕輕混勻后在室溫靜置15~20分鐘后,立即轉染。注意: DeofectEU-培養(yǎng)基混合物和DNA-培養(yǎng)基混合物的混合次序非常重要,切勿顛倒。

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